[发明专利]荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法

权利要求书

1.制备式（I）荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，

  （I）

其中取代基具有以下的含义：

M是H, Na或K

R1为H或OH

R2为H或OH

R3为C1-C8直链烷基(CH₂)n

Base为具有下列结构的碱基或碱基类似物取代基：

Dye为具有下列结构的荧光染料取代基团：

其中取代基具有以下的含义：

R4为OH, NH₂， N（Me）₂或N（Et）₂, N（Pr）₂

R5为O,或NH₂⁺, N（Me）₂⁺或N（Et）₂⁺, N（Pr）₂⁺

R6为H, F, Cl，Br或I

R7和R8为H或CH₂NH₂，或者具有以下结构的取代基：

R9为H，CH₃或CH₂CH₃

其特征是包括以下步骤：

a．将式（II）化合物

            （II）

Base为具有下列结构的碱基或碱基类似物取代基：

用DMF溶解,再加入氢氧化钠和树脂，搅拌均匀，振荡反应；再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤后，得到式（III）化合物

（III）；

b．将式（IV）化合物

 (IV)

其中FMOC为芴甲氧羰基

与式（III）化合物,碘化铜以及无水DMF混合，在氮气保护下, 注入无水三乙胺，在氮气的保护下，投入四(三苯基膦)钯, 反应结束后，再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤后，再加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基，得到式（V）化合物

    （V）；

c．将式（VI）化合物

（VI）

R10和R11为H或芴甲氧羰基氨基甲基，或者具有以下结构的取代基：

与式（V）混合于N,N’-二甲基甲酰胺中，加入羟基苯并三唑， N,N'-二异丙基碳二亚胺和DMAP4-二甲氨基吡啶，经酰胺化反应后，再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤，获得式(VII)化合物；R10和R11为芴甲氧羰基氨基甲基时，树脂洗涤后加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基后获得式(VII)化合物然后加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基后获得式(VII)化合物

（VII）；

d． 在所得的式(VII)化合物中加入盐酸，振荡后过滤，取滤液洗涤后冻干得到式(I)化合物。

2.根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，其特征是步骤a中的树脂为Merrifield树脂或者王树脂。

3.根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，其特征是步骤a中式（II）化合物与树脂混合时，式（II）化合物与树脂的摩尔比是1.5-3。

4.根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，其特征是步骤a, b和c中，反应结束后洗涤树脂的溶剂为N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇，醋酸水溶液的浓度为5-10%(w/v)。

5.根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，其特征是步骤b和c中六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液浓度为15-40%(v/v)。