[发明专利]一种单疱病毒潜伏感染细胞模型的建立及活化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物模型构建技术领域，具体涉及一种单疱病毒潜伏感染细胞模型的建立及活化方法，即用单纯疱疹病毒I型(HSV-1)体外静止感染原代兔角膜基质细胞来模拟潜伏期单疱病毒性角膜炎的细胞模型。

背景技术

单纯疱疹病毒I型(HSV-1)感染角膜所致的单疱病毒性角膜炎是一种严重的致盲性眼病，临床上尤以基质型最为常见。HSV-1的原发感染通常是无明显症状的，但病毒从此可在宿主体内潜伏。最近的研究表明在92%的正常人中可以通过PCR检测到HSV-1的DNA。HSV-1复发感染可以引起眼部病变，反复复发还可以引起角膜瘢痕形成、新生血管化，甚至失明。在美国，每年大约有59万的新发病例，其中25-42%的病人初发1-2年间又复发；而在我国城市盲目的调查中，角膜致盲占第二位，其中HSK引起的占角膜盲的首位（42.5%）。目前对于HSK还没有根治的药物或手术治疗方法，最终需要进行角膜移植治疗，这也是HSK在美国成为穿透性角膜移植手术数目第三位的主要原因。研究表明HSK难以治愈的主要原因是HSV-1可以在宿主体内建立潜伏，并反复复发，而对于潜伏建立、维持和复发的具体机制还并不清楚，故加强对本病潜伏、复发机制和临床对策的研究，已成为眼科亟待解决的课题。

HSV-1具有嗜神经特性，三叉神经节是国内外公认的HSV-1在体内的潜伏部位，但更多的实验证据和临床现象表明角膜是HSV-1在体内潜伏的又一部位。HSV-1能够在三叉神经节内潜伏感染是由病毒抗原、神经细胞及宿主免疫反应三者共同作用的结果，然而对于HSV-1在三叉神经节内潜伏的纯基础研究成果并未对解决单疱病毒性角膜炎反复发作提出建设性意见。越来越多的研究表明HSV-1也能够在角膜内潜伏，但目前仅限于在潜伏期宿主角膜内可以检测到病毒核酸或抗原，而对于HSV-1角膜内潜伏复发的机理还未有研究。

要研究HSV-1在角膜内潜伏复发的机理，那么建立HSV-1在角膜内潜伏复发的模型就很有必要。体内的动物模型目前已经在兔和小鼠角膜内成功建立，其方法就是HSV-1感染划伤的角膜，经过炎症较为严重的急性感染期后，角膜慢慢恢复透明，感染1-2个月后，HSV-1进入潜伏感染，然后利用250-300mJ/cm²强度的UV-B照射角膜，潜伏的HSV-1就可以活化，再次引发角膜炎。然而体内潜伏复发的模型并不十分稳定，动物间个体差异往往较大；每次的研究都需要一批的动物，造价往往较大；而且前后需要的时间也比较长；体内模型对于机理的研究并没有细胞模型那么方便。因此很有必要建立一种HSV-1在角膜细胞内潜伏感染的体外模型的方法，从而更方便准确的研究单疱病毒性角膜炎潜伏复发的机理，以及探讨并评价抑制其反复复发的药物。而目前为止，尚未见到有HSV-1在角膜细胞内建立体外静止感染并活化的模型报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种建立单纯疱疹病毒I型体外静止感染原代兔角膜基质细胞模型的方法，以便更准确、快速、经济的研究单疱病毒性角膜炎潜伏复发的机理，并进一步寻找抑制其反复复发的药物，从而弥补现有技术的不足。

本发明的方法，包括如下的步骤：

1）原代兔角膜基质细胞的培养

将去掉内皮的兔角膜酶解消化处理后，去掉上皮层并剪成小块，放入细胞培养液中进行培养，培养结束后，将培养的原代角膜基质细胞经细胞消化液消化后用于后续的细胞诱导分化；

其中所述的酶解消化，是将角膜放入Dispase酶中，4℃孵育过夜；然后放入37℃继续消化30分钟；

所述的细胞培养液的组成为DMEM-F12，且添加了10%（v/v）的FBS、终浓度为100U/mL青霉素和0.1mg/mL的链霉素；细胞经消化液为添加有0.25%（w/v）胰酶的0.02%（w/v）EDTA溶液。

2）原代兔角膜基质细胞的神经潜质诱导

将步骤1）制备的兔角膜基质细胞先用细胞培养液培养至细胞长至单层，然后换细胞诱导分化液对角膜基质细胞进行神经潜质诱导分化，37℃条件下诱导分化7-10天，3-4天换液一次；

所述的细胞诱导分化液为DMEM-F12，且添加有1%（w/v）BSA，50ng/mL注射用鼠神经生长因子NGF，青链霉素双抗（终浓度分别为100U/mL和0.1mg/mL）

3）HSV-1静止感染诱导原代兔角膜基质细胞