[发明专利]一种复合芽孢杆菌粉活菌含量的快速计数方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物含量测定的方法 ，具体涉及一种复合芽孢杆菌粉活菌含量的快 速计数方法 。

背景技术

芽孢杆菌制剂是一种无毒副作用 、无药物残留的绿色产品 ， 其产品中含有的活菌 是以内生孢子的形式存在 ，是畜禽水产养殖中常用的饲料添加剂和水质改良剂。然而缺少质量标准是芽孢杆菌制剂在开发研制中存在的主要问题之一 ，而导致质量标准缺乏的最大 的问题之一就是活菌数与标签不衍 ，有些甚至难以检测到活菌 。因此稳定可靠的芽孢杆菌 制剂的计数方法无疑对芽孢杆菌制剂正常生产及其质量控制具有重要的意义 。目前，显微 镜直接计数法 、平板菌落计数法等芽孢杆菌制剂的传统计数方法由于存在一些缺陷 ，使计 数结果不稳定 。例如显微镜直接计数法无法区分死菌体和活菌体 ，计数结果是死菌体和活 菌体的总和 ；平板菌落计数法操作繁杂 ，而且计数结果易受多种因素的影响 。

发明内容

 本发明的目的在于提供一种复合芽孢杆菌粉活菌含量的快速计数方法 。

本发明提供的一种复合芽孢杆菌粉活菌含量的快速计数方法  ，包括如下步骤 ：  1） 样品的制备 ：无菌操作随机称职复合芽孢杆菌粉 l g ，加入盛有 8mL 无菌营养肉 汤的 45mL 具塞离心管中 ，于漩涡振荡仪上振荡混匀制成1  :  10 的稀释母液，设 3 个平行 样 ；

2） 样品的稀释 ：取 3 个平行样 ，分别进行如下处理 ：无菌操作用 lmL 玻璃移液管 吸取 lmL    1  :  10 的稀释母液，加入盛有 8mL 无菌营养肉汤的 45mL 具塞离心管中 ，泪匀成1 : 10² 的稀释液，这样依次稀释 ，分别得到1 : 10³、1 : 10⁴、1 : 10⁵、1 : 10⁶、1 : 10⁷、1 : 10⁸、1 : 10⁸、1 : 10¹⁰、1 : 10^11、1 : 10¹²、1 : 10¹³ 稀释度的稀释液 ，每次稀释时必须更 换 lmL 玻璃移液管 ；

 3） 培养 ：将 1 : 10 的稀释母液以及 1 : 10²、1 : 10^3、1 : 10⁴、1 : 10⁵、1 : 10⁶、1 : 10⁷、1 : 10⁸、1 : 10⁸、1 : 10¹⁰、1 : 10¹¹、1 : 10¹²、1 : 10¹³ 的稀释液置于转速为 200r/min 、温度为 35 37 ℃的温控摇床中 ，培养 18-24h ；以盛有 8mL 无菌营养肉汤的 45mL 具塞 离心管作为对照 ；

4） 测定 ：以盛有 8mL 无菌营养肉汤的 45mL 具塞离心管作为对照 ，无菌操作用 lmL 玻璃移液管吸取 0. lmL 培养 18 24h 变浑浊的各稀释液采用 Schaef f er Fu l ton 氏染色法进 行芽孢染色 ，显微镜观察有无绿色的芽孢 ；显微镜观察有绿色芽孢 、且变浑浊的稀释液所对 应的稀 释度的倒数即为复合芽孢杆菌粉的活菌含量 （cfu/ g） 。

本发明可快速 、准确，直接观察测定出复合芽孢杆菌粉的活菌含量 。其原理是将 持测样品经过适当稀释之后 ，其中的芽孢杆菌充分分散成单个细胞 ，然后在无菌营养肉汤 中通过孵育培养而生长繁殖 ，从而形成肉眼可见的浑浊液 ，再进一步通过芽孢染色确定最大稀释度浑浊液中含有大量的芽孢 ，最后确定待测样品的活菌总数 。它与显微镜直接计数 法相比因能够区分死菌体和 t菌体而使 t菌总数的测定结果更准确 ，与平板菌落计数法相 比，操作更简单 ，更简易快速 ，更适合无很强专业技能的广大芽孢杆菌制剂生产从业者采用。

具体实施方式

实施例 1

 1材料与方法

1. 1 实验材料