[发明专利]单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒及应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种细菌性病原血清型的鉴别诊断，基于多重PCR方法，建立鉴定单增李斯特菌主要血清型的快速分型技术，即单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒及应用方法。

（二）背景技术

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是重要的人兽鱼共患食源性病原菌，对环境耐受性强，可在较高的盐浓度（10%NaCl）以及宽泛的pH（pH4.5～9）和温度范围（0～45℃）内生长，并可形成荚膜，因而单增李斯特菌广泛存在于自然界（包括土壤、水源、植物及动物体等），易污染各种食品（肉、奶、海产品及蔬菜等）。单增李斯特菌可引发胃肠炎、败血症、脑膜炎和流产等，其致死率（20～30%）远高于其他常见食源性病原菌，如肠炎沙门氏菌（约0.38%）、弯曲杆菌（0.02～0.1%）、弧菌（0.005～0.1%）等。2000年即被WHO食品安全工作计划列为检测的食源性致病菌之一，其危害严重性可见一斑。

根据菌体/鞭毛抗原（O/H）的血清学反应，单增李斯特菌可分为13个血清型，即1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e与7型。其中血清型1/2a、1/2b、1/2c与4b为主要血清型，占食品与病人分离株的99%以上；其他血清型则分离率极低。并非所有血清型均表现出相同的致病力。血清型1/2a在食品中分离率最高，但绝大多数暴发或散发的人侵袭型李斯特菌病病例由4b型引起，而胃肠炎型李斯特菌病病例多由1/2a型与1/2b型引起，其他血清型则鲜有引起人发病的案例。侵袭性李斯特菌病与胃肠炎李斯特菌病主要有如下差异：引发胃肠炎的污染食品携带菌量（pathogen load）大，发病急（18～27h），症状包括发热、腹泻、呕吐、关节痛与头痛等，感染者大多为健康人群；而侵袭性病例主要引发免疫力低下人群的致死性症状。脑膜炎病人的4b型分离率显著高于一般患者，且4b型感染者的死亡率（26%）明显高于其他血清型感染者（16%），提示4b型可能具有更胜一筹的毒力。因此，亟需建立可鉴别单增李斯特菌各主要血清型的快速分型方法。

目前，单增李斯特菌的血清型分型主要为血清学方法，依赖于商品化的菌体与鞭毛抗原，不仅价格昂贵，且存在操作费时、费力、交叉反应多发、试验结果不易判读等弊端，尤其不适用于大通量的分型操作。国内外通过比较基因组学方法，陆续筛选出血清型特异的基因位点，但迄今尚无单增李斯特菌主要血清型的快速分型方法。本发明将通过对血清型特异基因的分析、引物与检测条件的优化，设计一种准确、灵敏、简便、快速的多重PCR检测试剂盒，以期填补上述的空白。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种准确、灵敏、简便、快速的单增李斯特菌主要血清型分型试剂盒及使用方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F和冻存管G，所述冻存管A装有用于PCR反应的Taq DNA聚合酶、10×buffer、dNTP mixture和引物的混合液制备的冻干粉，冻存管B装有裂解液，冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F分别装有单增李斯特菌1/2a型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌1/2b型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌1/2c型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌4b型阳性对照缓冲液，冻存管G装有稀释液，所述稀释液为高压灭菌双蒸水；所述阳性对照缓冲液为单增李斯特菌EGD-e（血清型1/2a）、单增李斯特菌54004（血清型1/2b）、单增李斯特菌54002（血清型1/2c）、单增李斯特菌ATCC19115（血清型4b）分别接种在BHI培养基中，37℃培养过夜后，取菌液100℃煮沸灭活后离心弃去上清液，取沉淀用双蒸水重悬，制成阳性对照缓冲液样品；

所述冻存管A中引物的序列为：

L1-F：AGCAAAATGCCAAAACTCGT

L1-R：CATCACTAAAGCCTCCCATTG

L2-F：AGTGGACAATTGATTGGTGAA

L2-R：CATCCATCCCTTACTTTGGAC

L3-F：AGGGCTTCAAGGACTTACCC

L3-R：ACGATTTCTGCTTGCCATTC

L4-F：AGGGGTCTTAAATCCTGGAA

和L4-R：CGGCTTGTTCGGCATACTTA。