[发明专利]单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒及应用

权利要求书

1.一种单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F和冻存管G，所述冻存管A装有用于PCR反应的Taq DNA聚合酶、10×buffer、dNTP mixture和引物的混合液制备的冻干粉，冻存管B装有裂解液，冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F分别装有单增李斯特菌1/2a型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌1/2b型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌1/2c型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌4b型阳性对照缓冲液，冻存管G装有稀释液，所述稀释液为双蒸水；所述冻存管A中引物的序列为：

L1-F：AGCAAAATGCCAAAACTCGT

L1-R：CATCACTAAAGCCTCCCATTG

L2-F：AGTGGACAATTGATTGGTGAA

L2-R：CATCCATCCCTTACTTTGGAC

L3-F：AGGGCTTCAAGGACTTACCC

L3-R：ACGATTTCTGCTTGCCATTC

L4-F：AGGGGTCTTAAATCCTGGAA

和L4-R：CGGCTTGTTCGGCATACTTA。

2.如权利要求1所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于所述PCR反应管为100～300个。

3.如权利要求1所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于所述冻存管A内的冻干粉是将冻存管A内所述混合液先在-80℃预冻10h，再在-40℃持续冻干30h，然后以1.5℃/min的速率升温至25℃干燥2h使水分含量达到5%以下，获得冻干粉；所述每8μL混合液组成为：Taq DNA聚合酶0.4μL，10×buffer3μL，dNTP mixture0.6μL，浓度均为50μM的L1-F、L1-R、L2-F、L2-R、L3-F、L3-R、L4-F和L4-R引物各0.5μL，所述dNTP mixture由终浓度均为10mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP构成。

4.如权利要求1所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于冻存管B中所述裂解液终浓度组成为：体积浓度4%Triton-X100，5mg/mLNaN₃，1mol/L Tris，pH为8.0，溶剂为蒸馏水。

5.如权利要求1所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于每个试剂盒有100个PCR反应管，所述冻存管A内冻干粉的量以冻干前混合液的体积计为800μL，所述冻存管B内装有裂解液1mL，冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F各自装有阳性对照缓冲液0.5mL，冻存管G装有1.5mL稀释液。

6.一种利用权利要求1所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒进行单增李斯特菌主要血清型分型的方法，其特征在于所述分型方法按如下步骤进行：（1）将冻存管G中稀释液加至冻存管A，重悬、混匀制成混悬液，存放于-20℃备用；所述冻干粉用量以冻干前混合液体积计，所述的冻存管G中稀释液与混合液体积比为15:8；（2）将冻存管B中的裂解液分别加入PCR反应管，分为对照PCR反应管和待检PCR反应管，再依次将冻存管C、冻存管D、冻存管E和冻存管F中的阳性对照缓冲液加入相应对照PCR反应管内，将待检样品加入待检PCR反应管，分别混合均匀，然后再向各个PCR反应管内加入步骤（1）冻存管A内的混悬液，立即进行PCR扩增；所述待检样品为待检的单增李斯特菌接种在BHI培养基中，37℃培养过夜后，取菌液100℃煮沸灭活后离心弃去上清液，取沉淀用双蒸水重悬，制成待检样品；所述冻存管B中裂解液与冻存管A中混悬液的体积比为2:3，所述冻存管B中裂解液与冻存管C、冻存管D、冻存管E和冻存管F中的阳性对照缓冲液的体积比均为2:1，所述冻存管B中裂解液与待检样品体积比为2:1；

（3）将步骤（2）各个PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增：95℃预热3min；95℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸55s，25个循环；72℃保持5min；

（4）将步骤（3）扩增后的产物分别在质量浓度1%琼脂糖凝胶与0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统读取数据并记录；

（5）结果判定：检测后，待检样品与冻存管C内的阳性对照溶液同时扩增出691bp条带的为单增李斯特菌1/2a型阳性；待检样品与冻存管D内阳性对照溶液同时扩增出471bp条带的为单增李斯特菌1/2b型阳性；待检样品与冻存管E内阳性对照溶液同时扩增出691bp、906bp两条条带的为单增李斯特菌1/2c型阳性；待检样品与冻存管F内阳性对照溶液同时扩增出471bp、597bp两条条带的为单增李斯特菌4b型阳性；阳性对照溶液出现条带而待检样品无条带的为非单增李斯特菌主要血清型；待检样品与阳性对照溶液均无条带或待检样品出现条带而阳性对照溶液无条带的需重新检测并判定。