[发明专利]一种7α，15α双羟化DHEA P450酶基因的克隆及分析

说明书

技术领域

 本发明设计来源于亚麻刺盘孢霉菌（Colletotrichum lini）ST-1菌株的一种能对DHEA进行7α,15α-双羟化的P450酶，包括其完整的mRNA和DNA序列的克隆和分析，属于生物工程技术领域。

背景技术

自生物转化技术应用于甾体羟基化研究以来，人们已经发现了大量具有重要药理作用和药用价值的羟基甾体化合物，甾体羟化仍是目前研究甾体药物的热点之一。以去氢表雄酮（DHEA）、胆固醇、孕甾烯醇等一些3-羟基甾体为主，其在人体的器官和组织中，会转化成为相应的羟基甾体衍生物，并且具有重要的生物活性。其中，去氢表雄酮（DHEA）的双羟化产物7α,15α-diOH-DHEA，可用于合成多种甾体激素类药物，如避孕药的主要成分屈螺酮，其市场需求量极大，合成方法受到广泛的关注。

目前，7α,15α-diOH-DHEA的合成方法主要有传统的化学合成法和生物法。化学法具有反应步骤多，立体选择性差以及环境污染等缺点，故生物转化法受到众多研究者的青睐。利用生物转化法合成甾体羟化物反应过程中起主要作用的是P450酶系中的细胞色素P450单加氧酶。而细胞色素P450介导的生物转化研究中，由于P450酶表达量不高且野生菌蛋白分离纯化困难，严重阻碍了对其代谢反应的研究。近些年来，随着分子生物学技术的发展，人们开始尝试在真菌中克隆P450基因，在大肠或酵母等工程菌中进行异源表达，以大量提高P450酶的表达量并为P450酶的酶学性质研究提供基础。本专利中采用的C. lini ST-1在以DHEA为底物时，能大量生成7α,15α-diOH-DHEA，但其转化周期长，且全细胞催化易产生副产物。因此，C. lini ST-1中P450酶基因信息的获取，对该基因的异源表达具有一定的理论研究和工业应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种来自于C. lini ST-1的新型真菌细胞色素P450酶CYP X完整的mRNA和DNA序列的克隆和分析，该酶能高效转化DHEA为7α,15α-diOH-DHEA，该基因的获得为其异源表达及产业化生产奠定理论基础。

C. lini ST-1菌株由本实验室筛选，该菌于2012年4月24日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6501。

本发明的技术方案：

一种源自于C. lini ST-1的能对DHEA进行7α,15α双羟化的细胞色素P450酶CYP X，其基因完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2。获得完整mRNA和DNA序列的流程如图1所示。

所述的完整mRNA推导的CYP X氨基酸序列为SEQ ID NO: 3。

所述的CYP X完整的mRNA和DNA序列的克隆和分析方法：

（1）Colletotrichum lini ST-1总RNA的提取

菌株在产酶培养基（葡萄糖 15 g/L, 酵母膏 15 g/L, 玉米浆 3 g/L, NaCl 1.16 g/L, KH₂PO₄ 2.72 g/L, FeSO₄ 0.03 g/L,）中培养2天，培养温度30℃。真空抽滤收集菌体，并用无菌水洗涤2-3次，将湿菌体置于预冷的研钵中，加入1 mL Trizol试剂，低温匀浆2 min；匀浆液转移至1.5 mL离心管中，加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡30 s，室温放置 3 min，12,000 rpm 4 ℃离心10 min；吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入1/2倍无水乙醇 (v/v)，混匀；用移液器将混合液转至吸附柱中，室温下静置 2 min，12,000 rpm 离心 3 min，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中，加入 500 μL RPE溶液，静置 2 min，于10,000 rpm 离心 30 s，倒掉收集管中废液；重复该步骤一次；将吸附柱放回收集管中，10,000 rpm 离心 2 min；将吸附柱置于干净的 1.5 mL 离心管中，在吸附膜中央加入 30-50 μL DEPC处理水，静置 5 min，12,000 rpm 离心 2 min，将所得到的RNA 溶液用于后续试验。

（2）CYP X 3’端mRNA 序列的克隆