[发明专利]一种7α，15α双羟化DHEA P450酶基因的克隆及分析

权利要求书

1.一种来源于保藏编号为CGMCC No.6501的亚麻刺盘孢霉菌（Colletotrichum lini）ST-1菌株P450酶CYPX，其完整的mRNA和DNA的核苷酸序列分别对应于序列表中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:1，该酶能对DHEA进行7α,15α位双羟化。

2.权利要求1所述的7α,15α-双羟化P450酶CYPX，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

3.C. lini ST-1 CYPX完整mRNA和DNA序列的获取方法：

（1）C. lini ST-1 CYPX 3’端mRNA 序列的克隆：挑选Colletotrichum属的P450酶的氨基酸序列进行同源比对，发现在P450酶特征序列F--G---C-G的上游有一段保守序列；然后以该保守序列设计上游简并引物P1，以M13 Primer M4为下游通用引物，筛选含有特征序列F--G---C-G的目的片段；

FP1：5’-CCNGAGAGNTGGCTN-3’

M13 Primer M4：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

以C.lini ST-1总RNA为模板，使用AMV反转录酶进行反转录反应合成cDNA第一条链；以M13 Primer M4和FP1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为94℃ 2 min，30个循环：94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 45s，72℃ 10min；目的条带经克隆、测序得到C.lini ST-1 CYPX 3’端序列；

（2）C. lini ST-1 CYPX 5’端mRNA 序列的克隆：基于上述得到的CYPX 3’端mRNA 序列，设计两条反向引物RP1，RP2；

RP1：5’-TCCATCCAAGCAATGTAGCGGCCCA-3’

RP2：5’-TTCGTACGCT CCTCGCTCTCAAGCC-3’

将反转录合成的cDNA第一条链为模板、5’RACE Outer Primer和RP1为引物进行第一轮PCR扩增（94℃ 2 min；30个循环，94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 90s；72℃ 10 min）；以5’RACE Inner Primer和RP2为引物，进行第二轮PCR扩增：94℃ 3 min；30个循环，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s；72℃ 10 min；目的条带经克隆、测序得到C.lini ST-1 CYPX 5’端序列；

（3）C. lini ST-1 CYPX编码区DNA序列的测定：基于上述得到的C. lini ST-1 CYPX 5’和3’端mRNA序列，设计一对引物CYPX-P1，CYPX-P2；

CYPX-P1：ATGGCCATCCTCACCGTCGGCA

CYPX-P2：TCACACACGCTGTACCTGCGGC

以C.lini ST-1基因组DNA为模板，CYPX-P1和CYPX-P2为引物进行PCR扩增：4℃ 2 min；30个循环，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s；72℃ 10 min；目的条带经克隆、测序得到C.lini ST-1 CYPX编码区DNA序列。