[发明专利]基于亲和色谱测定超分子相互作用解离速率常数的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于亲和色谱的解离速率常数的测定方法，特别是针对相互作用较弱、较广泛的超分子相互作用。

背景技术

超分子一般是两个或两个以上分子的集合体，药物与辅料形成的超分子通常是主分子（超分子载体）与客分子（药物）通过氢键、范德华力等非共价相互作用形成的分子复合物。药物与超分子载体，如环糊精、冠醚和树枝状聚合物等，形成超分子复合物后能改善药物的水溶性、生物利用度和靶向性，在抗肿瘤、抗炎等领域发挥着重要作用。

主客分子之间的相互作用，即主客体识别，是超分子发挥其特殊功能的基础，不仅是超分子化学的研究内容之一，也是分子间相互作用的集中体现。主客体识别过程并非通过传统的共价键相结合，而是依靠分子间非共价键相互作用如：范德华力、静电力、疏水相互作用和氢键等实现结合。研究主客分子相互作用，有助于了解和揭示超分子结构与功能的内在关系，对阐明主客分子间的作用过程以及从分子水平上阐述超分子增溶、改善生物利用度的作用机理等方面具有非常重要的理论价值；同时对于以超分子体系给药的化合物筛选具有重要的实用价值。此外，也能为指导设计高效、低毒的主分子提供有价值的信息。但现有超分子相互作用研究大多停留在主分子衍生物合成、超分子表征、制剂制备和体外细胞活性等，有关超分子主客体相互作用的动力学研究较少。

主分子H（Host）与客分子G（Guest）所形成的非共价复合物H-G的生成与解离，分别可用双分子速率常数k_on及单分子速率常数k_off来表征。前者也称为结合速率常数k_a，后者也称为解离速率常数k_d。

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k_a、k_d又与结合平衡常数K_a具有公式（2）所示关系，已知任意两个，都可以求得第三个。定量测定k_a、k_d及K_a是研究分子间相互作用的首要内容，对于明晰相互作用的动力学过程、复合物的体外体内性质，以及客分子配体的设计和筛选具有重要意义。

研究主客分子间相互作用的方法主要包括离心法、平衡透析法、超滤法、光谱法、质谱法、核磁共振法、电化学分析法、量热法、生物活性回收和固定化配体法等。其中，固定化配体法中的亲和色谱和表面等离子共振技术，由于设备精度高，易于自动化操作和微量化，近来受到普遍关注。其主要原理是将一对能可逆结合和解离的主客分子的一方固定，当含有另一方的溶液流经时，固定的配基就会选择地与其结合，通过原位、动态检测溶液中分子的量随时间的变化规律，即可给出二者相互作用的热力学和动力学参数。

亲和色谱法与表面等离子共振法的区别在于相互作用的检测方式不同。表面等离子共振法是直接检测生物传感器表面的小分子，进而根据信号强弱变化计算相互作用参数，这种信号强弱与待测物的大小、浓度和相互作用亲和力有关。对于小分子或低浓度物质，如水溶性差的药物，检测难度较大，准确性也相对较差。加入有机溶剂或增溶剂可以改善难溶性药物在水中的溶解度，但这些添加剂的加入可能对测定结果有影响。因此，表面等离子共振法研究具有中等～较强亲和力的相互作用（K_a>10⁵M^-1）时，准确度和重现性较好。但不适合低浓度或难溶性小分子以及较弱或中等强度相互作用的研究。

与表面等离子共振法相比，亲和色谱法在检测方式上具有独特的优势，应用于相互作用研究时，并不受检测方式的限制。与常规色谱分析类似，亲和色谱可以与多种检测器相连，针对不同性质的待测物，可以选择紫外、荧光及质谱等多种检测器。对于低浓度、水溶性差的待测物，以及较弱或中等强度的相互作用，亲和色谱是准确测定其热力学、动力学参数的有力工具。