[发明专利]一种表达IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白重组火鸡疱疹病毒

说明书

一、技术领域

   本发明属于基因工程和生物制品研究领域。具体涉及一种表达IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重组火鸡疱疹病毒。

二、背景技术

鸡马立克氏病(Marek’s disease，MD) 和鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal

disease，IBD) 是两种影响家禽生产最常见的免疫抑制性疾病。其中IBD 是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV) 引起，主要危害3 周龄～12 周龄青年鸡的急性、高度接触性传染病。变异株和超强毒株（vvIBDV）的出现使该病的防控难度加大，IBD免疫预防失败已成为禽病防控中的重要问题。

目前商品化的传染性法氏囊病活毒疫苗分为弱毒、中毒和强毒三类。弱毒活疫苗

对SPF 鸡安全，但对有母源抗体鸡群的免疫保护力很差。中等毒力和强毒疫苗的免疫保护

力虽然要高很多，但由于具有一定的致病力而损伤法氏囊。同时，由于母源抗体的干扰以及IBDV 的特点，在实际应用中传统疫苗可形成不可避免的免疫空白期。因此，在当前IBD防控实际工作中，急需免疫效力强、生物安全性高新型IBD 疫苗。

MD 是由马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV) 引起的鸡淋巴组织增生性疾病，以外周神经、虹膜、皮肤、肌肉和内脏器官的淋巴样细胞浸润，增生和肿瘤形成为特征。MDV 疫苗株可作为活病毒载体来表达外源基因，对其分子生物学的研究表明，MDV基因组较大，并已经确定了多处病毒复制非必需区，其本身是优良的病毒表达载体。相较于其它病毒载体，MDV 作为载体具有独特的优势，MDV为严格的细胞结合型，可以突破母源抗体的干扰，适合早期免疫，通过鸡胚免疫，操作更方便。并且，一次免疫可诱发终生的细胞和体液免疫应答，节约成本。基于以上特点，以MDV 为载体进行的活疫苗研究倍受青睐，而火鸡疱疹病毒(HVT) 为其中的一种α 疱疹病毒，因其与MDV 抗原相关性，同时又由于HVT 与MDV 有明显区别对鸡无致病性，被广泛用作预防马立克氏病(MD)的活疫苗。

法氏囊(BF)是禽类特有的免疫器官，为B细胞发育、成熟提供微环境，是免疫球蛋白基因转变场所；其免疫活性物质为三肽囊素(Bursin，BS) ，它能诱导家禽和哺乳动物B细胞前体分化；其靶器官是BF，能够拮抗IBD疫苗对BF的损伤，提高ND弱毒疫苗及油苗产生抗体水平。因此如何能够以火鸡疱疹病毒(HVT) 为载体进行鸡传染性法氏囊病(IBD) 的高效活疫苗研究成为一项亟待攻克的难题。

三、发明内容

技术问题

本发明的发明人提供了一种重组火鸡疱疹病毒(rHVT-BS10-VP2)，不仅可以对鸡MD 起到良好的免疫保护作用，而且在具有高IBDV 母源抗体水平商品化鸡群中可以诱导抗IBDV 的持久保护性免疫。

技术方案  

一种表达IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重组火鸡疱疹病毒rHVT- BS10-VP2，其特征在于：其携带在启动子序列控制下的10拷贝法氏囊素三肽（BS10）嵌合IBDV VP2基因表达盒的基因序列如SEQ ID NO.1 所示。

所述的表达IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重组火鸡疱疹病毒rHVT- BS10-VP2，其制备方法如下：

1) 10拷贝法氏囊素三肽BS10寡核苷酸的合成：选用编码赖氨酸Lys、组氨酸His和甘氨酸Gly的常用密码子按顺序排列成BS基因：5'-AAGCATGGC-3’，连续合成l0个BS，BS 串连基因单链及其反向互补链，通过退火使其复性成双链；

2) 含IBDV VP2 和BS10 嵌合基因表达盒的火鸡疱疹病毒HVT转移载体的构建: 根据已注册的GenBank NO .X00221.1的gpt基因序列设计引物，以E.coliDH₅α DNA为模板采用PCR方法扩增gpt基因，用其作为外源筛选基因，与质粒pEGFP中的CMV启动子及poly(A)连接构建gpt表达盒CMV-gpt-poly A，经酶切测序验证后，插入到含有火鸡疱疹病毒HVT非必需区US10、SORF3两侧基因的同源臂克隆质粒pUAB中，构建带有筛选基因表达盒的克隆质粒pUAB-gpt；将BS10-VP2 嵌合基因插入到pUAB-gpt中，获得重组火鸡疱疹病毒转移载体pUAB-gpt-BS10-VP2 ，大小为10100bp；