[发明专利]一种用于猪病诊断的三重连接探针扩增检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物核酸分子检测技术领域，特别涉及一种新技术的新领域应用，即猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒核酸同步多重连接扩增技术检测方法。

背景技术

动物检验检疫问题成为了近些年国际社会关注的热点问题，我国加入WTO已逾十年，考虑到技术性贸易壁垒问题与输入性传染病风险问题，每年我国对大量进出口畜牧产品的卫生质量要求越来越高，要求检测项目也越来越多，如各种致病性病原体以及人兽共患病病原体等。同时为了确保食品卫生安全、保护国民健康安全，必须加强在源头上对畜产品进行安全性检测。目前应用于猪患病毒性传染病的检测方法有以下几种：聚合酶链式反应（PCR）、病毒分离培养鉴定法、电镜观察、酶联免疫吸附试验、免疫荧光试验等。现实中临床上发病猪往往以多种病毒混合感染为主，上述方法检测通量低成本高，操作不便，不利于同时多批量多重感染病原体的检测。

多重连接扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)由荷兰的Dr.Schouten JP于2002年发明，最初仅应用于医学检测目的，目前MLPA技术已应用于多种领域的研究及基因诊断，如单核苷酸多态性(SNP)和基因突变检测、染色体数目异常、遗传疾病基因缺失重复、基因甲基化检测、抑癌基因诊断及mRNA分析等。由于MLPA操作简便、成本低廉、应用领域广，这几年来，已有超过上百篇的研究报告发表，但是在动物疫病检测领域的应用尚无报道。

MLPA是将核酸的杂交检测和PCR链式扩增相结合，从而实现靶分子的高效特异性分析。其核心的技术是合成序列特异的长探针和短探针。短探针由两段核苷酸组成，一段是PCR扩增的通用引物，一段是病毒序列特异的探针。长探针由三段核苷酸组成，除了PCR扩增的通用引物互补序列和病毒特异性序列外，在两者之间还加入特定大小的填充序列（指纹序列）。当MLPA的两种探针结合到彼此相邻的靶序列上的时候，在连接反应时，长探针就和短探针发生连接，生成一条两端分别含有上下游通用引物的全长探针，并在通用引物的扩增之下，使模板成链式放大，实现靶分子的高灵敏度检测，其检测极限可达3000-6000个靶分子拷贝。

MLPA并不是扩增病毒特异的靶序列，而是扩增与病毒靶序列结合的探针，换句话说，首先是给每种病毒特异的探针加入特定大小的指纹序列，然后通过通用引物将不同的“指纹”扩增表现出来，最后通过对“指纹”的分析，实现多种核酸的检测，同时序列特异的两段探针确保了每种病原的指纹具有高度的特异性。MLPA利用核酸杂交、连接反应和PCR扩增反应，可以在同一试管内检测多达45种不同核酸序列拷贝数变化。

该技术主要包括：探针与靶序列的杂交、探针的特异化连接、连接探针的扩增和结果的检测分析。针对每一个待测靶基因序列，均有一对MLPA探针，其一般由一个短的寡核苷酸片段(短探针)和一个长的寡核苷酸片段(长探针)组成。该技术的特色之一是仅扩增连接完好的探针，而不是扩增样本靶序列。该技术的扩增环节仅需两条引物，即通用引物UP1和UP2。在所有短探针的5’端均有一段共同序列，该序列与引物UP1的核酸序列相同；在所有长探针的3’端均有一段共同序列，该序列与引物UP2的核酸序列互补。可见，所有连接探针的PCR扩增用的是同一对引物。若两探针连接，则扩增可进行；而若两探针未连接，则扩增无法进行。各长探针在共同序列和与靶序列互补的序列间有不同长度的填充片段，该片段长度不同使连接后的MLPA探针长度不同，故其扩增片段长度亦不同。一般相临两产物的长度相差6～8bp，因此可同时检测基因组的多种不同靶基因。扩增后进行结果检测分析比对，得出结论。

发明内容

本发明的目的是提供一种能同步检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒核酸的高特异性检测方法。所述的多重同步核酸定性检测方法的探针为选自以下病毒的特征片段：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒（CSFV）和猪伪狂犬病毒（PRV）。本发明能够同时检测三种常见猪混感病毒包括两种RNA病毒和一种DNA病毒，特异性极高。

本发明的一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒的靶核酸的探针和引物，包括如下的序列组：

1）针对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的探针

左翼探针Probe105L：5’TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTGGCGCTACTCTTGTACCAGATA 3’