[发明专利]一种用于猪病诊断的三重连接探针扩增检测方法

权利要求书

1.一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒的靶核酸的探针和引物，其特征在于，包括如下的序列组： 

1）针对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的探针 

左翼探针Probe105L：5’TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTGGCGCTACTCTTGTACCAGATA 3’ 

右翼探针Probe105R：5’TACCAACTTCCTTCTGGACACTGTGCCAGCAAGATCCAATCTC TCTGCACGATCCAATACCAC 3’ 

2）针对猪瘟病毒E2基因的探针 

左翼探针Probe125L：5’TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACA 3’ 

右翼探针Probe125R：5’GCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTGC CAGCAAGATCCAATCTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3’ 

3）针对猪伪狂犬病毒TK基因的探针 

左翼探针Probe150L：5’TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTTGCCAGCAAGATCCAATCTCCTG CGCAACGTCTACGCCAT 3’ 

右翼探针Probe150R：5’GCTGGTCAACACGTCGCGCTACCTGAGGTGCCAGCAAGATCCAAT CTGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3’ 

4）通用引物 

正向引物UP1：5′TGGTTCGCTTAGGGTTGGTT 3′ 

反向引物UP2：5′GTGGTATTGGATCGTGCAGAGA 3′。 

2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒的靶核酸的探针和引物，其特征在于：所述右翼探针的5’端经过磷酸化修饰。 

3.根据权利要求1所述的一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒的靶核酸的探针和引物，其特征在于：所述5’TGGTTCGCTTAGGGTTGGTT与通用的正向引物UP1序列相同；所述TCTCTGCACGATCCAATACCAC 3’与通用的反向引物UP2序列反向互补。 

4.一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒的三重同步核酸定性检测试剂，其特征在于：包括MLPA杂交液、MLPA连接液、PCR反应液、RNA/DNA共提液、RT反应液、阳性对照品、阴性对照品、探针混合液、通用引物混合液、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC处理水； 

MLPA杂交液包括SALSA MLPA buffer； 

MLPA连接液包括Ligase-65buffer A，Ligase-65buffer B，Ligase-65连接酶； 

PCR反应液包括2×Taq Master Mix； 

RNA/DNA共提液包括苯酚、8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇； 

RT反应液包括M-MLV5×Reaction Buffer、200U M-MLV反转录酶、2000U RNase抑制剂、10mM dNTP Mix； 

阳性对照品为含1.0×10⁸copy/ml浓度的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因、猪瘟病毒基因E2基因以及猪伪狂犬病毒TK基因的DNA片段； 

阴性对照品为不含高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因、猪瘟病毒E2基因以及猪伪狂犬病毒TK基因的pSURE-T重组质粒； 

探针混合液为权利要求1所述的左翼探针、右翼探针； 

通用引物混合液为权利要求1所述的UP1与UP2的混合液。 

5.根据权利要求4所述的一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒的三重同步核酸定性检测试剂，其特征在于：所述PCR反应液是由Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg²⁺、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂组成的预混体系，浓度为2×，预配好的PCR混合液中加入了溴芬蓝染料，反应结束后可直接进行电泳检测；75%乙醇需使用DEPC处理水配制。 

6.一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒的三重连接探针扩增检测方法，其特征在于有以下步骤： 

1）将疑似已经感染猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒的发病猪或死亡猪尸体内的血液、分泌液体以及淋巴结样品进行核酸提取处理，得到待测样品； 

2）将待测样品进行同步反转录处理，得到待杂交检测模板； 

3）将待杂交检测模板与探针进行杂交处理，得到杂交产物； 

4）将杂交产物进行连接处理，得到连接产物； 

5）将连接产物进行PCR反应处理，得到扩增产物； 

6）将扩增产物进行琼脂糖凝胶核酸电泳处理，随后进行凝胶成像分析得到检测结果。