[发明专利]快速检测猪萨佩罗病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及首次发明一种快速检测猪萨佩罗病毒的SYBR Gree  实时荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒可高效方便地对临床样本中猪萨佩罗病毒进行检测及定量，可以进行猪萨佩罗病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。 

背景技术

猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus, PSV)是一类无囊膜，微球型，单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，由于最初从腹泻猪的肠道中分离得到，所以先前称为猪肠道病毒8型(Porcine enterovirus 8,PEV-8)，归为猪肠道病毒II类群(Porcine enterovirus A，PEV A)。近年来，由于病毒基因组学及分子遗传进化分析的发展，该病毒已与亲缘关系较近的一类猿猴及禽小RNA病毒单独划分为萨佩罗病毒属，其也改称为猪萨佩罗病毒。 

PSV主要通过口腔进入体内，也有通过呼吸道等途径传播的，在粪便、呼吸道的分泌物及其污染物，都可携带病毒，导致其它易感猪的感染。PSV进入机体后，常引起腹泻，有时可引起病毒血症，可导致中枢神经受损，引起脑脊髓炎。怀孕母猪感染后，由于病毒血症经血源性传播，导致子宫感染引起胚胎和胎儿感染，造成胚胎死亡、死产、木乃伊胎和胎儿畸形等。 

近年来，随着规模化养猪业的发展及畜产品流通渠道的增多，我国猪群中肠道、呼吸道、生殖器官疾病以及脑脊髓炎等多系统综合征频繁发生，长期以来猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪捷申病毒(PTV)被认为是引起该类疾病的主要病原体，但PSV这个经典肠道病毒却一直没有引起相应的重视。 

鉴于此，研发一种快速检测猪萨佩罗病毒感染的荧光定量PCR试剂盒，可高效方便地对临床样本中猪萨佩罗病毒进行检测及定量，可用于猪萨佩罗病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。 

荧光定量PCR技术作为PCR技术的发展，以其独特的优势广泛应用于众多领域的研究中。为了建立一种较为快速准确的检测猪萨佩罗病毒的检测方法，本研究选择了SYBR Green I  荧光染料法。与TaqMan探针法相比较，SYBR Green I 荧光染料法操作简便，成本更为廉价。通过优化实时荧光定量PCR反应体系参数，我们发明了一种用于猪萨佩罗病毒检测的SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒。该方法引入了特异性扩增引物以及SYBR Green Buffer体系，使得检测的灵敏度和特异性得到了很大程度的增强，并避免了漏检和误检，该试剂盒能够达到快速准确检测的目的。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猪萨佩罗病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪。该检测方法相对于传统的检测方法具有灵敏度高、效率高的优点。 

本发明试剂盒可以应用于（抗）猪萨佩罗病毒药物的研究，可对生物制品进行定量检测及质量监控，可用于猪萨佩罗病毒引起的流行病学的调查。总之，该试剂盒能够为相关的基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。 

为了达到以上目的，本发明采取以下技术方案。 

1.试剂盒的组成 

a)RNA裂解液，b) PrimeScript? RT Enzyme Mix I，c)逆转录反应液，d)定量引物F及R e) SYBR? Premix Ex Taq II，f) ROX Reference Dye, g)标准阳性模板，h)阴性对照品i)无菌双蒸水

所述逆转录反应液含有5×PrimeScript? Buffer， Oligo dT Primer，Random 6 mers引物。

荧光定量引物F及R，分别为（SEQ ID NO 1）和（SEQ ID NO 2）所示的核苷酸序列。 

标准阳性模板是含有猪萨佩罗病毒特异性目的片段的质粒，该质粒转化到大肠杆菌DH5a增殖后用碱裂解法提取，经过 DNA纯化试剂盒纯化，分光光度计吸光值A260下定量，-20℃保存。 

阴性对照样品由SPF猪粪便样品中提取RNA，经过逆转录获得的cDNA样品。 

SYBR? Premix Ex Taq II液含有TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR? Green I，购自大连宝生物公司。