[发明专利]一种以金属离子为标记的多目标DNA生物传感器的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以金属离子为标记的多目标DNA生物传感器的制备方法。

 

背景技术

铋膜电极对重金属离子（如Cu⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺等）具有优异的电化学响应。与汞电极相似，在还原电位作用下，铋离子与重金属离子可被还原成合金，此合金可被重新氧化成金属离子，在电极上表现出尖锐且对称的氧化信号。与汞电极相比，铋是一种环境友好材料，近年来受到科学家们的青睐。研究表明，铋膜电极不仅能对不同的重金属离子进行同时检测，而且检测限较低。然而，用金属离子作为探针DNA的标记物尚未见报道。

金属硫蛋白（MT）是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。MT富含巯基，通常，每一个MT分子能结合7个二价金属离子或12个单价金属离子。而且，MT能结合多种金属离子，如Cu⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺等等。MT与金属离子的结合是一个质子竞争反应，在碱性条件下，MT能与金属离子结合，而在酸性条件下，MT与金属离子的结合位点被质子占据，从而释放出金属离子。另一方面，金属饱和的金属硫蛋白仍有部分未反应的巯基，可用于进一步的交联反应。

4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）是一类含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂。其中，NHS 活性酯是氨基活性基团，在pH 7～9的环境下与氨基反应生成酰胺键；马来酰亚胺是巯基活性基团，在pH 6.5～7.5的环境下与巯基反应生成稳定的硫醚键，因此，SMCC可以分别将含有巯基和氨基的化合物键接在一起。因此，只要对探针DNA序列进行末端氨基修饰，就能利用SMCC将其与含巯基的金属化的MT交联起来，生成金属离子标记的DNA检测探针。

发明内容

基于上述，本发明的目的在于提供一种以金属离子为标记的多目标DNA生物传感器。

本发明的目的是这样实现的：

a.金属硫蛋白（MT）的金属化

称取金属硫蛋白冻干粉置入小烧杯中，用0.02 M、pH为8.6的三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl ）缓冲溶液溶解，再加入100摩尔当量的二硫苏糖醇，在N₂保护下室温搅拌1 h，搅拌完毕后，用HCl或HClO₄快速将溶液的pH调至1.0，再通过超过滤的方式用0.05 M HCl或0.1 M HClO₄反复洗涤以除去解离下来的金属离子，得到纯化的金属硫蛋白，保存于4℃冰箱中，备用；再从冰箱中移取三份纯化金属硫蛋白溶液于小烧杯中，分别加入8摩尔当量的Zn²⁺, Cd²⁺、Pb²⁺，在N₂保护下剧烈搅拌20 min后，滴加0.5 M三羟甲基氨基甲烷将金属硫蛋白溶液调至相应的pH 值，温下继续搅拌1 h，过量的金属离子通过超过滤的方式除去，得到锌-金属硫蛋白、镉-金属硫蛋白、铅-金属硫蛋白；

b.金属化的金属硫蛋白与NH₂-DNA的交联反应

将交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）溶解于二甲基亚砜中，保存于4 ℃冰箱中，备用，使用前稀释溶液，使二甲基亚砜的最终浓度为5%，锌-金属硫蛋白、镉-金属硫蛋白和铅-金属硫蛋白分别与40摩尔当量的交联剂和 NH₂-DNA在室温下反应 1 h，交联反应在pH 7.4 的0.1 M 磷酸氢二钠/磷酸二氢钠（PBS） 溶液中进行，反应完毕后，未反应的交联剂和 NH₂-DNA通过超过滤的方式除去，制得Zn²⁺, Cd²⁺、Pb²⁺金属离子标记的检测探针；

c.杂交过程