[发明专利]一种以金属离子为标记的多目标DNA生物传感器的制备方法

权利要求书

1.一种以金属离子为标记的多目标DNA生物传感器的制备方法，其步骤是：

a.金属硫蛋白的金属化

称取金属硫蛋白冻干粉置入小烧杯中，用0.02 M、pH为8.6的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液溶解，再加入100摩尔当量的二硫苏糖醇，在N₂保护下室温搅拌1 h，搅拌完毕后，用HCl或HClO₄快速将溶液的pH调至1.0，再通过超过滤的方式用0.05 M HCl或0.1 M HClO₄反复洗涤以除去解离下来的金属离子，得到纯化的金属硫蛋白，保存于4℃冰箱中，备用；再从冰箱中移取三份纯化金属硫蛋白溶液于小烧杯中，分别加入8摩尔当量的Zn²⁺, Cd²⁺、Pb²⁺，在N₂保护下剧烈搅拌20 min后，滴加0.5 M三羟甲基氨基甲烷将金属硫蛋白溶液调至相应的pH 值，室温下继续搅拌1 h，过量的金属离子通过超过滤的方式除去，得到锌-金属硫蛋白、镉-金属硫蛋白、铅-金属硫蛋白；

b.金属化的金属硫蛋白与NH₂-DNA的交联反应

将交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜中，保存于4 ℃冰箱中，备用，使用前稀释溶液，使二甲基亚砜的最终浓度为5%，锌-金属硫蛋白、镉-金属硫蛋白、铅-金属硫蛋白分别与40摩尔当量的交联剂和 NH₂-DNA在室温下反应 1 h，交联反应在pH 7.4 的0.1 M 磷酸氢二钠/磷酸二氢钠溶液中进行，反应完毕后，未反应的交联剂和 NH₂-DNA通过超过滤的方式除去，制得Zn²⁺, Cd²⁺、Pb²⁺金属离子标记的检测探针；

c.杂交过程

将含捕捉探针DNA的TE溶液滴到金基底上，将金基底放置于封闭的塑料盒里；过夜后，用超纯水淋洗金基底，然后插入0.1 mM 己硫醇溶液中培养2 h，接着用超纯水彻底淋洗金基底，再将金基底浸入200 μL 含有Zn²⁺, Cd²⁺、Pb²⁺金属离子标记的检测探针DNA和相应的目标DNA的溶液中杂交，令其在水浴60 ℃中培养5 min后，自然冷却至室温；杂交完成后，将金基底浸于100 μL 1 M HCl中，保持10 min，使检测探针上的金属离子释放下来，待测；

d.方波阳极溶出伏安法检测金属离子

将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经浓度为95 %的乙醇、超纯水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极，插入含有1mM铁氰化钾探针分子的0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸的玻碳电极进行表征；再将玻碳电极取出用超纯水冲洗并吹干，备用；将三电极体系插入含有Bi³⁺和待测金属离子的0.1 M、pH 4.5的乙酸缓冲溶液中，开启搅拌，在－1.4 V的作用下用方波伏安法电沉积120 s，将Bi³⁺和待测金属离子原位共沉积到玻碳电极上，形成含有待测金属的铋膜，以－1.3 V为初始电位，－0.3 V为末电位，频率20 Hz，振幅25 mV，跃阶电势5 mV，静止时间10 s，进行方波阳极溶出伏安扫描；

e.采用origin软件作图，绘制步骤d所得的方波阳极溶出伏安曲线和峰电流与目标DNA浓度的线性关系图。