[发明专利]真鲷虹彩病毒分子标准样品及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于检测用病毒培养物标准品及其制备方法技术领域，具体涉及真鲷虹彩病毒标准样品及其制备方法。 

背景技术

我国是世界上最大的水产品生产和输出国，目前，我国水产品总量已占全球渔业总产量的40%，连续15年居世界首位，养殖水产品产量占世界养殖总产量的70%。水产品在保障国家粮食安全、促进农民增收和农村经济稳步发展中发挥了重要作用。我国水海产品出口面临的壁垒主要为绿色壁垒，如日本的“肯定列表制度”、欧盟的《欧盟食品及饲料安全管理法规》及有关法令、美国的《最严谨的水产养殖规范》（BAP）等，欧盟启动了对我国进口人工养殖海产品的审查；韩国政府也禁止我国34家水产养殖企业向韩国出口鱼类等水产品，严重制约了我国水产品的出口增长。 

真鲷虹彩病毒(Red sea bream iridovirus RSIV)属于虹彩病毒科Iridoviridae,细胞肿大病毒属Megalocytivirus(Hossainet al.2003),是在养殖的海水鱼中经常发生并且危害较大的病毒病。该病首次报导是1990年，在日本四国的真鲷养殖场，养殖的真鲷大量死亡。自1991年，该病就在日本西南部的18个区流行并造成20多种养殖的海水鱼群严重损失。受感染的包括鲈形目、鲽形目和鲀形目的鱼。引起养殖鱼群主要是真鲷鱼苗的大批死亡。不过也有关于商品规格的鱼死亡的报导。此后就在各种海水养殖鱼类中流行并造成很大的损失。1998年该病在南韩流行，引起60%的鲷鱼和鲈鱼死亡。现在已经传到台湾，据报道使养殖的石斑鱼损失很大。我们曾经从自台湾和泰国进口过来的鲈鱼中检出过RSIV，由于该病毒造成的危害极大，OIE列为重要传染病。 

由于养殖生态环境恶化，疾病预防意识差，滥用药物普遍，水生动物种苗质量不高，防疫体系不健全等原因导致水生动物发病。系统内送检鱼的样品通常眼观来看都比较健康，而真鲷虹彩病毒通常只有在适宜的温度下才能发病，而且现在用的PCR方法只能从重度感染表现出临床症状的鱼中检出病毒，无法检测潜在的病毒。随着进出口贸易的增大，检验流程时限要求缩减，鱼类疫病多 数要细胞进行先增殖，而普通的水生动物疫病实验室很难得到该病毒，对实验室的质量控制及研究带来了极大的挑战。 

为了帮助实验室建立好的质量保证，辽宁出入境检验检疫局从2006年就开始从事水生动物疫病及标准样品的研究工作。本标准样品的研制成功，不仅为检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定性高、均匀性好的真鲷虹彩病毒分子标准样品及其制备方法。 

为了得到所述真鲷虹彩病毒分子标准样品，根据真鲷虹彩病毒（RSIV）DPO基因部分序列，设计特异性引物，其碱基序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。 

本发明的真鲷虹彩病毒分子标准样品，采用如下方法制备： 

（1）采集感染真鲷虹彩病毒的鱼组织，经剪碎、研磨、得鱼组织匀浆液； 

（2）将鱼组织匀浆液加入到长成单层的GF细胞中，吸附1小时后，加入培养基继续培养、待细胞感染病毒脱离时，回收细胞经反复冻融、离心得细胞上清液； 

（3）步骤（2）得到的细胞上清液中提取得到病毒DNA； 

（4）步骤（3）的病毒DNA作为PCR反应模板，进行PCR扩增反应，其中PCR反应的正反引物分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2； 

（5）将步骤（4）的PCR扩增产物经纯化后连接至PGEM-T载体中，连接产物转化至感受态细胞后，LB平板培养，筛选得到阳性克隆； 

（6）阳性克隆中提取得到质粒，即为真鲷虹彩病毒分子的标准样品。 

上述制备方法中，所述GF（Grunt fin）细胞系为石鲈鳍细胞系，由ATCC购买。 

上述制备方法中，在步骤（2）中所述培养基为L-15培养基；在步骤（5）中筛选阳性克隆的方法为PCR方法，其中PCR反应的正反引物分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。 

上述制备方法中，在步骤（1）中所述的鱼组织包括脑、肝、肾和脾。 

本发明的真鲷虹彩病毒分子标准样品稳定性高、均匀性好，为真鲷虹彩病毒的检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫 机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。使用本发明的标准样品可以实现不同实验室结果的比对，从而保证实验室的质量控制。