[发明专利]一种处理液以及采用其测定铝盐吸附型疫苗中抗原含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及吸附型灭活疫苗中抗原解吸附的处理液及所述抗原的含量测定方法。

背景技术

乙型脑炎病毒抗原是乙型脑炎灭活疫苗中的主要有效成分，其有效含量与疫苗接种后的保护效果直接相关，因此，其抗原含量是乙型脑炎灭活疫苗质量控制中的一项重要检测项目。

目前，对乙型脑炎病毒抗原含量的检测大多采用酶联免疫吸附法，其原理是将可溶性的乙型脑炎病毒单克隆抗体或高纯度的多克隆抗体吸附在酶联反应板上，使供试品中的待检抗原与其发生特异性结合，再加入酶标抗体，使其与吸附在酶联反应板上的抗原结合形成免疫复合物，通过酶反应底物在酶的作用下产生显色反应，并根据颜色变化对供试品中的抗原做定量分析。这种方法具有操作简便、准确度高等优点，但是其检测结果易受供试品中其他非抗原成分的干扰，出现假阳性或假阴性结果。并且，乙型脑炎灭活疫苗中的抗原为灭活病毒抗原，在接种后诱导机体产生的免疫反应要弱于减毒疫苗，因此，为了使接种者更有效的获得免疫，常需要加入佐剂制备成吸附型疫苗，诱导机体对病毒抗原产生免疫识别。铝盐佐剂是目前惟一可用于人体的佐剂，这类佐剂包括氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、铝佐剂。它们会与抗原表面携带的负电荷基团发生共价或配位结合，以颗粒的方式包裹抗原，与可溶性抗原一起形成沉淀，从而使复合物更具免疫性。铝盐佐剂与抗原的结合屏蔽了抗原表面的特异性结合位点，进而在抗原的体外检测过程中，抗原无法与酶联反应板或酶标抗体上的特异性抗体相结合，从而导致抗原检出量偏低或无法检出。针对这一类吸附疫苗还没有成熟的抗原含量检测方法，特别是对吸附乙型脑炎疫苗的病毒抗原检测，也未见文献报道。

目前国外对于铝盐吸附疫苗中的抗原含量检测也仅处于研究阶段。相关研究表明铝盐佐剂与抗原之间的相互吸附作用主要是通过以下三种方式实现：静电吸引力、疏水作用以及配基交换作用。为了能够准确测定吸附疫苗中的病毒抗原，需要首先破坏抗原与佐剂之间的这三种相互作用力，使抗原先从佐剂上解离下来，暴露出抗原表面上相应的抗原决定簇，再通过酶联免疫吸附法或电泳等方法对其进行检测。据文献报道，一些金属离子螯合剂、表面活性剂、有机酸、乙二醇等物质可以针对抗原与佐剂之间存在的一种或几种相互作用力进行破坏，达到解离抗原的目的。因此，以这些化学物质为基础设计的样品处理液屡见报道，主要有如下两种样品处理液：

以不同浓度的表面活性剂（包括十六烷基磺酸钠，曲通-100，西氯吡铵，盐酸胍）作为样品处理溶液，其作用机理可能是通过表面活性剂与抗原的交联作用使其从铝佐剂上解离下来。文献表明，使用10mM的阳离子表面活性剂西氯吡啶处理氢氧化铝佐剂吸附的卵清蛋白疫苗，其解离效果最好，卵清蛋白的回收率可达50%。但是，几乎所有的表面活性剂都会或多或少的对蛋白质的结构造成破坏，引起蛋白质变性，因此抗原回收率很少达到60%。同时，不同蛋白质的理化性质不同，对同一种表面活性剂的耐受程度也会存在较大的差异。吸附乙型脑炎灭活疫苗中的乙脑抗原在阳离子表面活性剂以及阴离子表面活性剂中均较易受到破坏：实验表明，使用5mM的西氯吡啶溶液或使用浓度为0.1-5%的十二烷基磺酸钠溶液对铝佐剂吸附乙型脑炎灭活疫苗处理5分钟，都会对乙脑抗原表面的特异性靶点结构造成损害，导致抗原无法检出。在表面活性剂中，尿素属于温和变性剂，对抗原结构的影响较小，但将其应用于吸附乙型脑炎灭活疫苗的解吸附，其抗原回收率也仅有20%左右，这表明乙型脑炎病毒抗原的结构容易受到表面活性剂的破坏，表面活性剂并不适宜作为吸附乙型脑炎灭活疫苗样品的处理液。