[发明专利]云芝及含有云芝的制剂的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种云芝及含有云芝的制剂的检测方法，具体涉及云芝药材以及含有云芝、或云芝有效部位、或云芝有效部位群的制剂的质量控制和评价方法。

背景技术

云芝为多孔菌科真菌彩绒革盖菌Coriolus versicolor (L.ex Fr.) Quel干燥子实体。东汉时期《神农本草经》已有记载以云芝治疗癌症，《本草纲目》记载云芝有安神、益寿、利关节、坚筋骨、治耳聋作用。现代研究表明，从云芝中提取的云芝多糖用于肿瘤患者的辅助治疗，能显著提高癌症病人的生存质量，增强免疫，减少继发感染，缓解病痛，改善癌症患者的食欲减退作用。由于云芝多糖的独特活性与低毒效应在临床应用中具有极大的潜力，针对云芝多糖类成分开发的保健品、药品日益增加，1977年，从云芝中提取纯化的云芝多糖（PSK），在日本被开发成抗癌新药Krestin；1998年，以从云芝中提取纯化得到的云芝多糖肽（PSP）为主要成分的云芝糖肽胶囊正式获得我国卫生部的正式生产批准文号，目前已上市产品有云芝糖肽、云芝菌胶囊、云芝肝泰片、云芝肝泰胶囊等。目前，国内总多糖含量测定主要采取紫外分光光度法进行，经典的显色体系有苯酚-硫酸法（λmax=490nm）和蒽酮-硫酸法（λmax= 630nm），均选择无水葡萄糖为对照品。也有采用滴定法测定总多糖含量的，常用有斐林氏滴定法和间接碘量滴定法。如2010版《中国药典》中，云芝药材中的总多糖含量测定就采用的是间接碘量法。由于云芝药材及其制剂大多为有色样品，应用此类方法测定样品中的云芝总多糖时，方法的干扰因素多，结果准确度、专属性差。在国外对多糖的质量控制多采用高效凝胶色谱法测定多糖分子量及其分布，这也是对多糖产品质控手段之一，其对纯度较高的多糖产品质量控制较好，能有效的评价该产品的真伪。国内云芝类产品也有采用高效凝胶色谱法测定多糖分子量及其分布，以此来评价该类产品的质量，此方法能在一定程度上控制产品的质量，但对于主要含多糖类成分的云芝药材及其制剂的质量控制方法较少，由于它们所含的有效多糖是一大类，很难对其多糖含量、分子量分布范围来评价药材及其制剂质量的真伪和优劣，该评价方式不能反映它们整体的内在质量变化，存在一定的不合理性和不科学性，且专属性也较差。同时，云芝药材及其制剂中多糖分子组成、空间结构不同，而以相应对照品测得的样品多糖的分子量，并非分子量的绝对值。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确度高、专属性强、操作简便的云芝及含有云芝的制剂的检测方法，以便更好进行质量控制和评价。

本发明根据云芝药材及其制剂多糖的单糖组成是其一级结构的主要内容，是其空间结构的基础，首先需要将其多糖进行完全酸水解为单糖类物质之后，其中所含单糖的成分、各单糖成分含量的相互比例应该是具有物种唯一性和个体相似性的，因此，针对其开展的色谱分析，所获的色谱图谱具有较强的专属性。采用液相色谱分离检测技术，分析云芝药材及其制剂中多糖的单糖组成，建立相应的特征图谱，通过运用多糖中单糖组分特征图谱的相对保留时间和相对峰面积来评价该药材真伪，该质量控制和评价方法具有较强的专属性和创新性。同时，在特征图谱的基础上，建立单糖组分定量测定，并制定各含量限度，通过对单糖质量的控制可间接控制多糖的含量，以此质量控制方法评价药材质量的优劣，该质量控制和评价方法具有较高精确度和新颖性。

本发明的技术方案是：

取云芝药材3～6g（加水适量，加热回流提取，提取液离心，量取适量提取液,减压浓缩至适量）或制剂0.5～1g（加水使溶解），加入3～6倍体积的无水乙醇，分取沉淀，沉淀加水溶解，并加入稀硫酸（浓度为10%），100-120℃加热回流水解5-6小时，水解后溶液调pH至中性并定容，吸取上清液，置具塞试管中，加入NaOH溶液和PMP的甲醇溶液，于60～80℃衍生化反应30-60min，反应完全后调PH至中性并定容，取上清液加等体积三氯甲烷振摇提取，弃去有机溶液，重复操作3次，水溶液减压浓缩至适量用乙腈定容，作为供试品溶液；取D-甘露糖、D-葡萄糖、半乳糖和L-岩藻糖对照品适量，加水溶解，按上述供试品溶液的衍生方法制备混合对照品溶液，分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪或超高效液相色谱仪，测定各单糖含量。其中超高效液相色谱检测条件是：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.3～1.0毫升/分钟；检测波长245nm；以乙腈为流动相A，以磷酸缓冲盐溶液（称取K₂HPO₄ 4.4g，加水800mL溶解，加磷酸调pH至6.5，并加水稀释至1000mL）为流动相B，流动相梯度洗脱表：