[发明专利]用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP引物、试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于细菌耐药基因检测技术领域，特别涉及用于检测KPC、NDM、IMP和VIM基因的LAMP引物、试剂盒及其检测方法。

背景技术

碳青霉烯类抗生素是目前抗菌谱最广，抗菌活性最强的非典型b-内酰胺类抗菌药物。由于其对b-内酰胺酶稳定和毒性低的特点，该类药物已经成为目前治疗多种细菌感染的主要抗菌药物之一。然而，随着其临床应用日益广泛，碳青霉烯类抗生素不可避免地出现细菌耐药现象，这些菌株也大都表现为泛耐药。近年来，耐碳青霉烯的非发酵菌甚至肠杆菌科细菌的报道都越来越多，对于这种耐药菌株的快速检测并预防其流行在临床工作中极为重要。

    近几年对于耐药性的调查研究显示，产碳青霉烯酶是细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。对于这类产酶菌株的监测最快速有效的方法是检测其耐药基因。针对临床常见且水解活性强的碳青霉烯酶进行分子生物学方法检测其相关基因成为急需的实验室技术。KPC（Klebsieila pneumoniae carbapenemase，KPC）是引起肠杆菌科细菌对碳青霉烯耐药的主要原因，而NDM（New Delhi metallo-b-lactamase）是引起世界关注的新发现的强水解活性的碳青霉烯酶，IMP和VIM（Verona integron-encoded MBL）是临床中常见的具有强水解碳青霉烯活性的金属b-内酰胺酶。上述四个基因可以涵盖非发酵菌和肠杆菌科细菌常见碳青霉烯酶基因，进行快速检测对于及时发现并进一步控制这类细菌的流行有很重要的临床意义。

目前用于检测碳青霉烯酶基因的主要技术是PCR，如多重PCR，荧光定量PCR。但这些方法或操作不够简化快捷，或检测成本高需要特殊仪器设备。而近几年新兴起的基因扩增方法，环介导等温扩增方法（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP），主要是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物及2条辅助成环引物，在恒温条件下即可完成核酸扩增反应，且可以达到成本低，操作简便，检测时间短，灵敏特异的检测目的基因。这项技术自发现起已广泛用于检测细菌领域，并有相关专利获得授权。虽国内已有发明利用LAMP方法检测NDM-1（申请号20111029784.4），但由于NDM基因因存在位点的突变，有多个亚型，此发明不能满足NDM基因所有型别的检出。而且也没有IMP、VIM、KPC基因的检测。因此，对于碳青霉烯酶基因的检测是不够全面的。本发明更是针对上述四个基因国内临床常见亚型的基因保守区设计特异的LAMP引物，以便能更敏感特异的检出相应的基因片段。在引物设计的基础上，我们基于LAMP的方法建立了一种能对同一标本的KPC、NDM、IMP和VIM四种碳青霉烯酶基因进行检测的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一组用于检测细菌常见碳青霉烯酶基因（KPC、NDM、IMP和VIM）的LAMP引物，并建立一种常见碳青霉烯酶基因的LAMP检测试剂盒及其检测方法，以灵敏特异、简便快速的检测细菌常见碳青霉烯酶基因。

本发明所采取的技术方案是：

用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP引物，包括KPC引物组、NDM引物组、IMP引物组和VIM引物组，其核苷酸序列分别如下所示：

1) KPC引物组： 

外引物：

KF3：GTATCGCCGTCTAGTTCTG（SEQ ID NO.1），

KB3：TGAATGAGCTGCACAGTG（SEQ ID NO.2）；

内引物：

KFIP：AATGGTTCCGCGACGAGGCTGTCTTGTCTCTCATGGC（SEQ ID NO.3），

KBIP：GGACTTTGGCGGCTCCATGCGCGGTAACTTACAGTT（SEQ ID NO.4）；

环引物：

KLoopF：GGCAGAAAAGCCAGCCAG（SEQ ID NO.5），

KLoopB：CGATGGATACCGGCTCAG（SEQ ID NO.6）；

2) NDM引物组： 

外引物：

NF3：AACACAGCCTGACTTTCG（SEQ ID NO.7），

NB3：GCTCATCACGATCATGCT（SEQ ID NO.8）；

内引物：

NFIP：ATGTCGGTGCCGTCGATCCCCGCTCAAGGTATTTTACC（SEQ ID NO.9），