[发明专利]一种猪肚菇低温型菌株选育方法

权利要求书

1.一种猪肚菇低温型菌种选育方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、筛选在20℃下出菇的猪肚菇子实体分离单孢子；

步骤二、采用低温驯化猪肚菇单核菌株，选出在较低温度下生长快的单核菌株；

步骤三、通过杂交育种，选育出低温型杂交菌株；

步骤四、通过拮抗试验和分子标记技术对选育杂交菌株进行鉴定。

2.如权利要求1所述的猪肚菇低温型菌种选育方法，其特征在于，所述步骤一的详细步骤为：

1）子实体培养：选取棉籽壳83%，麸皮15%，石灰2%，含水量63%作为栽培培养基，将培养基按照配方拌料、装袋，灭菌、接种和培养，菌丝满袋后移入塑料菇棚采用袋内覆土出菇，覆土厚度3－4cm，菇棚每天定时通风，喷水保湿，常规方法进行出菇管理；

2）分离单孢子实体的获得：每天观察菇棚温度的变化，当温度较低时观察不同菌株的子实体生长情况，在菇棚温度20℃时选取仍然发生的子实体，采下子实体用于分离单孢；

3）单孢子分离：采用常规稀释法分离单孢，在收集有孢子的玻璃瓶中加入灭菌的玻璃珠数十粒，加入无菌水剧烈振荡稀释孢子液；同时用血球计数板计数，选取PDA培养基：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL；采用梯度稀释涂布100μl孢子浓度10³个/mL的孢子液到PDA平板上；试验时为防止细菌污染在培养基中添加500mg/L卡那霉素。

3.如权利要求1所述的猪肚菇低温型菌种选育方法，其特征在于，所述步骤二的详细步骤为：

1）低温驯化处理：将涂有孢子的平板置于25℃恒温培养，定期观察孢子萌发情况，当孢子萌发出现肉眼可见的微小白点时，置于4℃冰箱低温驯化45d，然后在无菌条件下将低温驯化处理的单孢挑取至PDA平板上，置于20℃恒温培养；

2）单核菌株的鉴定：当单孢在平板上长至菌落1cm大小时，挑取菌丝于载玻片上显微镜检，观察显微下菌丝形态，挑选无锁状联合的为单核菌丝体；分别编号；

3）单核菌株在不同温度下的菌丝生长速度试验

将单核菌株分别接种到PDA平板培养基的中央，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃温度下培养，每个菌株三次重复；采用十字画线法，从接种第二天菌丝生长尖端为起点，精确测量菌落直径，观察记录其生长势并按照下列公式计算菌丝生长速度：

菌丝生长速度（mm/d）=菌落半径（mm）/菌丝生长天数（d）；

4）选择在25℃生长最好且在15-25℃之间生长较好的单核菌株作为选育低温型菌株的亲本单核菌株。

4.如权利要求1所述的猪肚菇低温型菌种选育方法，其特征在于，所述步骤三的详细步骤为：选取两亲本单核菌株的菌丝体接入PDA平板上，相距1-2cm，然后放置于25℃恒温培养，待两菌块的菌丝生长至互相交接时，于交接处挑取一块大的菌丝体进行显微观察，出现锁状联合的说明可以杂交，将杂交成功的菌丝体转接到试管斜面上培养备用，后将杂交菌株分别接种到PDA平板培养基的中央，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃温度下培养，每个菌株三次重复，采用十字画线法，从接种第二天菌丝生长尖端为起点，精确测量菌落直径，观察记录其生长势并按照下列公式计算菌丝生长速度，

菌丝生长速度（mm/d）=菌落半径（mm）/菌丝生长天数（d），

以选取的亲本猪肚菇栽培菌株为对照，选取子实体形成温度低于常规菌株的杂交菌株，并记录温度。

5.如权利要求1所述的猪肚菇低温型菌种选育方法，其特征在于，所述步骤四杂交菌株鉴定中，子实体培养基采用麦芽汁培养基。