[发明专利]一种胞外分泌表达κ-卡拉胶酶的重组菌构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及表达κ-卡拉胶酶的重组菌构建方法及其应用。

背景技术

κ-卡拉胶酶(κ-carrageenase，EC3.2.1.83)主要来源于海洋细菌，通过裂解κ-卡拉胶的β-1,4-糖苷键产生不同分子量的卡拉胶寡糖。卡拉胶酶的用途广泛，如红藻细胞壁结构分析，红藻原生质体的制备和卡拉胶寡糖的制备等。现已报道，卡拉胶寡糖及其衍生物具有很好的生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、抗凝血等。因而引起人们的极大关注，现已成为医药、农业、食品等领域研究与开发的高科技竞争热点。

然而，传统的化学和物理降解方法反应条件不易控制、产物分布不均匀，根本无法进行大量高纯度寡糖的制备。因此，反应条件温和、底物专一的卡拉胶酶成为目前制约卡拉胶寡糖构效关系研究乃至进一步应用开发的主要瓶颈，获得高效的κ-卡拉胶酶产生菌和高活性的κ-卡拉胶酶具有重要的科研和应用价值。

κ-卡拉胶酶来源广泛，主要包括微生物和海洋动物。能够产生κ-卡拉胶酶的微生物大部分来自海洋细菌，已经在假单胞菌属、别单胞菌属、Zobellia菌属、噬纤维菌属、弧菌属等中检测到。为了发挥模式微生物，如大肠杆菌(Escherichia coli)等易培养、发酵工艺成熟和生产周期短的优点，利用模式微生物进行异源表达生产κ-卡拉胶酶不失为一种有效的酶改造途径。现在已经有许多蛋白在大肠杆菌中实现表达，但大多数异源表达的蛋白容易形成包涵体积聚在细胞质中，无法大规模的回收活性蛋白。

重组酶的分泌表达特别是胞外生产具有以下优点：①所表达的重组酶经特定的蛋白酶切后的氨基酸序列与天然基因序列所编码的蛋白一致，保证了蛋白的天然构象和活性。②胞外分泌的重组酶回收过程不需要细胞破碎，同时菌株自身分泌胞外蛋白量少，简化了纯化步骤。③分泌表达的重组酶在周质空间中容易形成正确的二硫键，因为周质空间提供了相对优越的氧化环境。④重组酶的胞外分泌利于发酵过程的连续化，结合高密度培养技术，过程容易放大。重组酶的分泌能力取决于宿主菌、表达载体、信号肽的类型和异源表达蛋白的种类。基于上述优点，目前通过反复实验法选择适用于特定重组酶的信号肽和异源表达宿主菌，以实现其胞外分泌表达的报道已有很多。但重组酶胞外分泌的能力大小不一。有关重组κ-卡拉胶酶胞外分泌表达的报道较少，Tohru Kobayashi等曾报道用大肠杆菌表达系统分泌表达κ-卡拉胶酶，无论是总体酶产量还是胞外酶比例都处于较低水平。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有胞外产κ-卡拉胶酶的重组菌。

本发明提供的重组菌是含有κ-卡拉胶酶前体基因的大肠杆菌。

上述κ-卡拉胶酶前体基因的编码序列如GenBank号为KC503903所示，其中包含有该κ-卡拉胶酶的原始信号肽序列。

上述κ-卡拉胶酶前体基因cgkZ是通过重组表达载体A导入大肠杆菌当中，得到重组κ-卡拉胶酶产生菌BL21-HTa-cgkZ.

上述重组表达载体A是将所述κ-卡拉胶酶前体基因cgkZ插入pProEX-HTa的多克隆位点得到的重组表达载体pProEX-HTa-cgkZ。

所述载体pProEX-HTa-cgkZ是pProEX-HTa经BamH1和XhoI双酶切得到的片段，与同样酶切得到的κ-卡拉胶酶目的片段连接得到。

上述重组菌在产κ-卡拉胶酶中的应用也属于本发明所保护的范围之内。

上述应用是指将所述的重组菌在改良LB培养基中发酵培养；所述发酵条件为20-28℃，pH为4.0-6.5，转速130-180rpm。

本发明采用大肠杆菌作为宿主菌分泌表达κ-卡拉胶酶。由于完整的蛋白质序列是κ-卡拉胶酶成熟并产生活性所必需的，因此将κ-卡拉胶酶前体编码核苷酸序列置于强启动子lac的调控之下，并将κ-卡拉胶酶原始信号肽OmpZ与表达载体连接构建分泌型表达质粒pProEX-HTa-cgkZ，导入大肠杆菌得到的重组菌BL21-HTa-cgkZ.该重组菌具备大量胞外分泌重组κ-卡拉胶酶的能力，约51％的酶可以被分泌到胞外，约33％的酶滞留在细菌壁膜间隙。得到的重组酶不需要特定的蛋白酶进行酶切就能表现出较高酶活力，在优化后的摇瓶试验条件下，重组菌BL21-HTa-cgkZ在诱导发酵28h时，发酵液中κ-卡拉胶酶的酶活达9.4U／mL。

附图说明

图1为κ-卡拉胶酶前体基因(GenBank序列号KC503903)

图2为胞外分泌型载体pProEX-HTa-cgkZ示意图。

图3重组κ-卡拉胶酶酶学性质曲线。