[发明专利]一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶

权利要求书

1.一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，是在环糊精葡萄糖基转移酶N-末端融合了自组双亲短肽，构建短肽融合型环糊精糖基转移酶。

2.根据权利要求1所述的环糊精糖基转移酶，其特征在于，是以Genbank AF047363.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶基因序列为出发序列，在该酶的N-末端融合自组双亲短肽，构建短肽融合型环糊精糖基转移酶。

3.根据权利要求1所述的环糊精糖基转移酶，其特征在于，所述短肽融合型环糊精糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的环糊精糖基转移酶，其特征在于，所述自组双亲短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

5.携带编码权利要求1所述环糊精糖基转移酶的基因的质粒、基因工程菌和转基因细胞系。

6.一种产权利要求1所述酶的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：

1）采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶基因；

2）将步骤1）获得的短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；

3）将步骤2）获得的重组表达载体转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)得到基因工程菌。

7.一种应用权利要求6所述方法构建得到的大肠杆菌基因工程菌。

8.一种应用权利要求7所述基因工程菌发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，以产短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌为生产菌株，活化后按4%接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；在30℃摇床培养至OD₆₀₀=0.6，加入0.1mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集富含环糊精葡萄糖基转移酶的上清液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，向所述上清液中加入70%固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用A、含20-480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A的洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脱液；活力组分在50mM磷酸钠缓冲液（pH=6）中透析过夜后，分别得到纯化的融合酶SAP1-CGTase和SAP2-CGTase。

10.权利要求1所述环糊精糖基转移酶在生产2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸中的应用。