[发明专利]淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种淮山药温和花叶病毒的NIb/CP蛋白原核表达、多克隆抗体制备、检测及其应用。

背景技术

淮山药又称山药、淮山，为薯蓣科植物，其块根富含淀粉、蛋白质、维生素、氨基酸及多种药用成分如胆碱、皂甙、粘多糖等，还含有Fe、Zn、Cu、Ca等多种矿物质，依据种和品种的不同，可作药用或食用，具有良好市场前景和产业开发潜势。病毒病严重影响淮山药的产量和品质，在淮山药生产上造成重大损失。文献表明，全球范围内，自然条件下侵染淮山药的病毒有杆状DNA病毒属的参薯杆状病毒(Dioscorea alata bacilliform virus，DaBV)、淮山药花叶病毒(Yam mosaic virus,YMV)、淮山药温和花叶病毒(Yam mild mosaic virus,YMMV)、中国淮山药坏死花叶病毒（Chinese yam necrotic mosaic virus，CYNMV）、日本淮山花叶病毒（Japanese yam mosaic virus，JYMV）、蚕豆萎蔫病毒2（Broad bean wilt virus-2，BBWV-2）。我国已发现DaBV、YMMV、JYMV、CYNMV和BBWV-2侵染淮山药，引发的症状包括花叶、斑驳、脉明、褪绿、生长迟缓和叶片扭曲等。不同淮山药病毒引起症状不同，也可以引起相似症状；其传播介体不一样，有不同的传播途径。为了保证淮山药生产的正常进行，首先要保证种薯不携带病毒，其次是在生产大田及时发现和鉴定病毒，以便制定有针对性的防治措施，包括控制传播介体来切断病毒病的传播。因此，要求有灵敏度高、特异性好的病毒检测技术来对淮山药的种薯和田间样本进行检测。目前，用于植物RNA病毒病原检测的主要技术手段有RT-PCR、IC-RT-PCR、qRT-PCR、LAMP-PCR、ELISA、Western blot等，在病毒病原检疫检测方面应用最多的是ELISA和qRT-PCR。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用，以便用于快速检测淮山药温和花叶病毒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备方法，原核表达纯化淮山药温和花叶病毒的NIb/CP蛋白并用于免疫家兔制备多克隆抗体。

NIb/CP蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列的基因所编码。

上述的淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备方法，取纯化后的NIb/CP蛋白，采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，以后每2周加强免疫一次，共免疫4次；首次免疫加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂，后3次加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂；末次加强免疫7天后，心脏采血，分离血清；抗血清经抗原亲和纯化获得该病毒NIb/CP蛋白的多克隆抗体。

所得淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体在检测淮山药温和花叶病毒方面的应用。

基于上述多克隆抗体的淮山药温和花叶病毒的ELISA检测方法。

上述ELISA检测方法，包括以下步骤：

（1）用1mL抗原包被缓冲液研磨0.1g淮山药新鲜叶片，9000rpm离心5min，取上清液稀释20倍，按照100μl/孔加入ELISA板；以感染YMMV的病叶为阳性对照，未感染YMMV的健康叶为阴性对照，37℃孵育2h或4℃过夜；

（2）用200μl PBST洗涤两次后，用5%脱脂奶粉封闭30min；

（3）用200μl PBST洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释的YMMV多克隆抗体，100μl/孔，37℃孵育1h或室温孵育3h；

（4）用200μl PBST洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液稀释3000倍的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG结合物，100μl/孔，室温孵育1h；

（5）用200μl PBST洗涤三次后，用TMB底物显色试剂盒（康为世纪公司）进行显色，室温避光孵育25-30min，反应产物呈蓝色，每孔再加入50μl0.5M H₂SO₄终止显色，此时蓝色产物变为亮黄色，立即用酶标仪读取OD₄₅₀的值，以与阴性OD值比值（P/N）大于2.1为阳性；