[发明专利]淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用

权利要求书

1.一种淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备方法，其特征在于：原核表达纯化淮山药温和花叶病毒的NIb/CP蛋白并用于免疫家兔制备多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备方法，其特征在于：所述NIb/CP蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列的基因所编码。

3.根据权利要求2所述的淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备方法，其特征在于：取纯化后的NIb/CP蛋白，采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，以后每2周加强免疫一次，共免疫4次；首次免疫加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂，后3次加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂；末次加强免疫7天后，心脏采血，分离血清；抗血清经抗原亲和纯化获得该病毒NIb/CP蛋白的多克隆抗体。

4.权利要求1至3所得淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体在检测淮山药温和花叶病毒方面的应用。

5.基于权利要求1所述多克隆抗体的淮山药温和花叶病毒的ELISA检测方法。

6.根据权利要求5所述的ELISA检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）用1mL抗原包被缓冲液研磨0.1g淮山药新鲜叶片，9000rpm离心5min，取上清液稀释20倍，按照100μl/孔加入ELISA板；以感染YMMV的病叶为阳性对照，未感染YMMV的健康叶为阴性对照，37℃孵育2h或4℃过夜；

（2）用200μl PBST洗涤两次后，用5%脱脂奶粉封闭30min；

（3）用200μl PBST洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释的YMMV多克隆抗体，100μl/孔，37℃孵育1h或室温孵育3h；

（4）用200μl PBST洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液稀释3000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG结合物，100μl/孔，室温孵育1h；

（5）用200μl PBST洗涤三次后，用TMB底物显色试剂盒进行显色，室温避光孵育25-30min，反应产物呈蓝色，每孔再加入50μl0.5M H₂SO₄终止显色，此时蓝色产物变为亮黄色，立即用酶标仪读取OD₄₅₀的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性；

所述PBST含3.2mM Na₂HPO₄，0.5mM KH₂PO₄，1.3mM KCl，135mM NaCl，0.05%Tween20，pH7.4；所述抗原包被缓冲液为碳酸盐缓冲液，30mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6；所述抗体稀释缓冲液为1%BSA,0.01M PBS pH7.2。

7.基于权利要求1所述多克隆抗体的淮山药温和花叶病毒的Western blot检测方法。