[发明专利]用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法。 

背景技术

杆状病毒是一类DNA病毒，广泛存在于自然界，主要感染鳞翅目、双翅目和膜翅目昆虫，其感染能够导致昆虫的液化死亡。随着研究的深入，杆状病毒已在生物杀虫剂、真核表达、表面展示以及基因治疗等方面得到越来越广泛的应用。为使杆状病毒能在应用中发挥最大的功效，就必须对杆状病毒进行定量，即进行病毒滴度的测定。 

病毒滴度即病毒的毒力或毒价。在相关技术中，杆状病毒滴度普遍采用终点稀释法（endpoint dilution）进行测定，指能使半数细胞出现病变的病毒稀释度。该方法需通过观察细胞病变来确定病毒的滴度。在测定过程中，可以有一些方法是采用Sf9昆虫细胞为被感染细胞的。 

但是，由于Sf9昆虫细胞是一种圆形的细胞，当被杆状病毒感染后，其病变主要表现为细胞核膨大；而Sf9昆虫细胞在细胞老化时也容易出现细胞核膨大的现象，因此，通过观察很难判断细胞核膨大的现象是否是由杆状病毒所致，进而造成病毒滴度测定的结果不准确。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法，以解决上述的问题。 

本发明的实施例提供了一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，该重组细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC No.C2013133；其保藏命名为：携带P基因的斜纹夜蛾卵巢细胞系Sf9-p，其保藏日期为2013年9月4日。 

在本发明的实施例中还提供了一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，其构建方法包括以下步骤： 

构建报告质粒；所述报告质粒包括其中插入了编码绿色荧光蛋白的报告基因、诱导所述报告基因表达的所述杆状病毒的晚期基因的启动子P基因； 

利用所述报告质粒转染Sf9昆虫细胞； 

将转染后的所述Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆； 

将所述单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系。 

本发明实施例提供的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，其整合了能够编码绿色荧光蛋白的报告基因以及诱导所述报告基因表达的所述杆状病毒的晚期基因的启动子P基因。重组细胞系在受到相应启动子来源的病毒（杆状病毒）的感染后，杆状病毒早期基因的表达产物将激活位于报告基因上游的杆状病毒的晚期基因的启动子，从而启动了报告基因的表达得到绿色荧光蛋白。在进行杆状病毒滴度测定时，该重组细胞系通过观察被感染细胞的荧光产生而非细胞病变（如，Sf9昆虫细胞的细 胞核膨大）则可确定杆状病毒的滴度。而感染后的发出荧光的细胞可通过常规的通过流式细胞仪等仪器进行定量，进而使得测定结果更为准确。 

本发明的实施例还提供了一种利用该重组细胞系测定杆状病毒的滴度的方法，包括以下步骤： 

将重组细胞系制成细胞悬液； 

在待测的杆状病毒液中加入所述细胞悬液，恒温培养预定时间后通过观察荧光情况进行病毒滴度计算，得到滴度。 

附图说明

图1示出了本发明实施例二提供的重组细胞系的构建方法流程图； 

图2示出了本发明实施例二提供的重组细胞系测定杆状病毒的滴度的方法流程图； 

图3示出了本发明实施例一和实施例提供的报告质粒的结构示意图。 

具体实施方式

下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。 

实施例一 

在本发明的实施例中提供了一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法，包括以下步骤： 

构建报告质粒； 

其中，所述报告质粒包括其中插入了编码绿色荧光蛋白的报告基因、诱导所述报告基因表达的所述杆状病毒的晚期基因的启动子P基因； 

利用所述报告质粒转染Sf9昆虫细胞； 

将转染后的所述Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆； 

将所述单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系。