[发明专利]检测松材线虫的方法、检测引物及其LAMP检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测植物线虫的试剂盒，尤其涉及一种检测松材线虫（Bursphelenchus xylophilus）的方法、专用的LAMP检测引物及LAMP检测试剂盒，属于松材线虫的检测领域。

背景技术

松材线虫（Bursphelenchus xylophilus）病又称松树萎蔫病，可在短时间导致松树死亡，是松树上的一种毁灭性病害。该病寄主包括黑松、赤松和马尾松等数十种松属植物，也危害少数非松属针叶树（朱克恭，朱正昌，严敖金.松材线虫的流行与研究进展[c].中国松材线虫病的流行与治理[M].北京：中国林业出版社，1995.）。日本1905年首次报道了该病在长崎县引起松树大面积枯死。目前该病分布于美国、加拿大、墨西哥、葡萄牙、韩国、日本及中国等多个国家，其中在日本、中国和韩国发生最为严重（Khan F A，Gbadegesin R A.On the occurrence of nematode induecd pine wilt disease in Nigeria[J].Pakistan Journal of Nematology，1991(9)：57-58.Mota M M，Braasch H，Bravo M A，et a1.First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe[J].Nematology，1999，l：727-734.）。中国自1982年在南京中山陵首次发现该病短短30年时间里，疫情已扩大到江苏、安徽、广东、浙江、山东、福建、江西、广西、四川等16个省区，每年发生面积近10万hm²，累计致死松树5000多万株，直接经济损失25亿元，间接损失250亿元。因此，加强对松材线虫病的检疫，防止其远距离传播是治理松材线虫病工作的主要任务。

松材线虫检疫方法主要有形态学观察和分子生物学检测两种。形态学检测方法存在以下缺点：（1）由于寄主、环境、地理位置等外部因素的影响，松材线虫种内和种间的形态都有了较大的变化，作为形态鉴定特征重要依据的雌虫尾尖突、尾形、雄虫交合伞形状等常常会发生一些变化，给准确鉴定带来很大难度。（2）由于线虫形态学鉴定必需有具有专业知识人才和仪器设备的机构进行，致使形态学观察的应用范围受到很大的限制。随着分子生物学的发展，许多基于遗传物质的分子检测方法快速发展起来，由于其具有准确、快速、高效等优点，为有效地开展检测和控制工作提供了很好的方法，逐渐成为主要的检测方法之一。分子生物学检测方法不仅具有准确、快速、成本低的优点，而且由于可以直接从枯死松木中检出松材线虫，大大节省了时间，因此，近年来已被广泛应用于松材线虫的检疫检测工作中，具有非常好的应用前景。

松材线虫分子检测是通过分析松材线虫DNA特有的基因组区域而对其做出准确的鉴定。因此，获得高质量的松材线虫基因组DNA是分子检测过程中最关键的步骤。传统提取木片中松材线虫的方法为CTAB法，这种方法的主要缺点是：需要较多的样本、提取时间长、过程繁琐、必需在实验室进行、不能应用于野外环境，因此无法满足实际检测需要。公布号为CN 102016030 A的中国发明专利申请公开了一种直接从木片中提取松材线虫DNA的方法，这个方法虽然具有需要样品量少，检测时间短的优点，但存在检测试剂不易保存、检测费用昂贵的缺点。松材线虫病的检验检疫部门多在基层单位，试验条件相对较差，公布号为CN 102016030 A的专利申请使用的DNA提取液中含有酶类物质，必须-20℃保存，而偏远山区的检测检疫部门可能不具备试剂储存条件。另外，该申请方法使用的DNA提取试剂盒（ISOHAIR,nippongene）价格昂贵（50元人民币/样品），在实际工作中，检测样品量大，一般检测检疫部门无法承担使用这种方法产生的高昂检测费用。本领域迫切需要稳定性强、成本低、操作方法简便的从木块中提取松材线虫基因组DNA的方法。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换型DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温65℃左右保温几十分钟快速进行核酸扩增的方法。由于其具有快速、简便、特异性好、灵敏度高、成本低等优点,已经应用于临床诊断、食品卫生检疫及基因芯片的开发。采用环介导等温扩增技术成功检测松材线虫的关键是需要针对松材线虫的靶基因设计出特异性强、灵敏度高的LAMP引物组，现有的用于检测松材线虫的LAMP引物组，不同程度的存在着特异性差、灵敏度低的缺陷，有待改进。