[发明专利]检测松材线虫的方法、检测引物及其LAMP检测试剂盒

权利要求书

1.一种检测松材线虫的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）从待检测的松树木材样品中提取松材线虫基因组DNA；（2）以提取的DNA为模板，加入包括LAMP引物组、Bst DNA聚合酶在内的组分建立LAMP反应体系，进行环介导等温扩增；（3）根据扩增产物荧光的有无或浊度的变化，判定待检测的松树木材样品中是否存在松材线虫。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）采用2-10%的Chelex-100作为提取缓冲液提取松树木材样品中松材线虫DNA，优选的，采用5%的Chelex-100作为提取缓冲液提取松树木材样品中的松材线虫DNA；更优选的，先用异硫氰酸胍提取缓冲液处理松树木材样品，再加入2-10%的Chelex-100提取松树木材样品中的松材线虫DNA。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的从待检测的松树木材样品中提取松材线虫DNA的方法，包括以下步骤：

（1）向待检测的松树木材样品中加入异硫氰酸胍提取缓冲液搅拌混匀，冰上放置后，沸水煮3-10min；（2）按w/v计，加入2-10%Chelex-100搅拌混匀，沸水煮5-15min，离心，取上清液，即得；其中，步骤（1）中所述的冰上放置时间优选为3-10min，更优选为5min，沸水煮的时间优选为5min；步骤（2）中所述的沸水煮的时间优选为8min。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的LAMP引物组选自以下5组引物中的任意一组：

4号引物组：由上游外部引物SEQ ID NO.13、下游外部引物SEQ ID NO.14、上游内部引物SEQ ID NO.15和下游内部引物SEQ ID NO.16组成；

18号引物组：由上游外部引物SEQ ID NO.17、下游外部引物SEQ ID NO.18、上游内部引物SEQ ID NO.19和下游内部引物SEQ ID NO.20所示的引物组成；

1F引物组：由上游外部引物SEQ ID NO.21、下游外部引物SEQ ID NO.22、上游内部引物SEQ ID NO.23和下游内部引物SEQ ID NO.24所示的引物组成；

8号引物组：由上游外部引物SEQ ID NO.25、下游外部引物SEQ ID NO.26、上游内部引物SEQ ID NO.27和下游内部引物SEQ ID NO.28所示的引物组成；

13号引物组：由上游外部引物SEQ ID NO.29、下游外部引物SEQ ID NO.30、上游内部引物SEQ ID NO.31和下游内部引物SEQ ID NO.32所示的引物组成。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：在所述5组引物组中还含有一条SEQ ID NO.33所示的环引物。

6.用于检测松材线虫的LAMP引物组，其特征在于，选自以下5组引物中的任意一组：

4号引物组：由上游外部引物SEQ ID NO.13、下游外部引物SEQ ID NO.14、上游内部引物SEQ ID NO.15和下游内部引物SEQ ID NO.16组成；

18号引物组：由上游外部引物SEQ ID NO.17、下游外部引物SEQ ID NO.18、上游内部引物SEQ ID NO.19和下游内部引物SEQ ID NO.20所示的引物组成；

1F引物组：由上游外部引物SEQ ID NO.21、下游外部引物SEQ ID NO.22、上游内部引物SEQ ID NO.23和下游内部引物SEQ ID NO.24所示的引物组成；

8号引物组：由上游外部引物SEQ ID NO.25、下游外部引物SEQ ID NO.26、上游内部引物SEQ ID NO.27和下游内部引物SEQ ID NO.28所示的引物组成；

13号引物组：由上游外部引物SEQ ID NO.29、下游外部引物SEQ ID NO.30、上游内部引物SEQ ID NO.31和下游内部引物SEQ ID NO.32所示的引物组成。