[发明专利]检测基因表达量的引物、探针和试剂盒、及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及基因检测的引物、探针和试剂盒，尤其涉及一种检测ERCC1、RRM1、TUBB3、TYMS基因表达量的引物、探针和试剂盒、使用方法及应用。

背景技术

随着医学研究和药物研发水平不断进步，越来越多的治疗肿瘤类药物被开发出来，但是，一些患者在使用某些药物进行治疗时效果并不理想，表现为肿瘤对药物敏感度低，耐药性强等，研究表明这一现象与人体内的某些基因过表达有关。

铂类药物是最常用的肿瘤化疗药物之一，它主要通过引起肿瘤细胞内DNA的交联形成加合物，阻碍DNA合成与复制，从而抑制肿瘤细胞的生长。ERCC1是核酸切除修复系统NER（nucleotide excision repair）的一个关键基因，NER可以切除加合物并修复被损伤的DNA，从而降低化疗效果，因此，ERCC1在mRNA中的高表达与铂类药物的耐药性有关。

吉西他滨是临床上用来治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌及其他实体肿瘤的一种抗肿瘤药物，药物进入细胞后，可通过一系列的磷酸激酶活化，生成三磷酸核苷类似物，与DNA合成的底物竞争从而掺入DNA链，中断DNA的合成。临床研究表明，RRM1基因的表达水平与吉西他滨疗效负相关，RRM1mRNA表达水平低的非小细胞肺癌患者，在接受吉西他滨和铂类药物联合化疗后有较好的应答，其中位总生存期也比RRM1mRNA表达水平高的患者长，此外，RRM1在胰腺癌中的高表达也会导致患者对吉西他滨产生抗性，美国国家综合癌症网络非小细胞肺癌临床实践指南（2011）已经将RRM1表达水平作为治疗的预测生物标记，因此，检测RRM1表达水平对于预测吉西他滨的疗效是非常必要的，RRM1表达水平低的患者采用吉西他滨为主的化疗疗效较好。

抗微管类化疗药物是作用于细胞微管，通过影响纺锤体形成，从而抑制细胞有丝分裂的一类光谱化疗药，细胞内微管蛋白分为α、β两个亚型，是细胞骨架的中药组成部分，是有丝分裂时纺锤体的基本组成单位，也是抗微管药物的主要作用靶点。据研究显示，TUBB3基因编码的β-Tubulin-Ⅲ（3型β微管蛋白）与抗微管化疗药敏感性的关系最密切，低TUBB3mRNA表达水平的肿瘤患者接受抗微管类药物化疗的效果较好，中位生存期较长，反之，高TUBB3mRNA表达水平的肿瘤患者的抗微管类药物化疗疗效较差。

氟类药物是尿嘧啶的氟代衍生物，可在细胞内转变为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸（5F-dUMP），从而抑制脱氧核苷酸合成酶，阻止脱氧核苷酸（dUMP）甲基化为脱氧胸苷酸（dTMP），进而影响DNA的合成，另外，也能掺入RNA中干扰蛋白质的合成，从而达到抑制肿瘤生长的作用。TYMS（Thymidylate Synthetase）基因编码的胸苷酸合成酶（TS）是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是肿瘤生长的重要因子，同时它是氟类药物在体内作用发挥细胞毒作用的目标酶，氟类药物在体内转化为5-FU，5-FU的代谢物与TS结合，阻碍TS的正常功能，从而抑制DNA合成。众多临床研究结果都显示TYMS基因的mRNA表达水平与氟类药物疗效密切相关，低TYMS mRNA表达水平的肿瘤患者接受氟类药物化疗的效果较好，反之，TYMS高表达的患者接受氟类药物化疗的效果较差。

上述研究结果都表明，在一线治疗的恶性肿瘤患者中检测ERCC1、RRM1、TUBB3和TYMS基因的表达量具有重要的临床意义，是正确对患者用药治疗的先决条件。

过去对上述四个基因表达量的检测方法主要通过Nothern blot法，该方法需要提取RNA，使用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置标示其分子量的大小，以显影强度提示目标RNA在所测样品中的相对含量。这个方法繁琐费时，而且对RNA要求较高，并且RNA非常容易降解，致使结果不稳定，灵敏度不高，需要的样本RNA量非常大才能保证检测结果。

目前实时荧光定量PCR技术蓬勃发展，它是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，该技术不仅实现了PCR的定量检测，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。

发明内容