[发明专利]一种实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法

说明书

技术领域

本发明属于柑橘黄龙病检测技术领域，尤其涉及一种实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法。

背景技术

柑橘黄龙病（CitrusHuanglongbing，HLB）是世界柑橘生产上最具毁灭性的的病害之一，国内外植物检疫的重要对象。目前HLB主要分布在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50个国家和地区。柑橘黄龙病病原菌能侵染各种柑橘类植物，症状有斑驳型黄化、均匀型黄化、缺素型黄化和“橡皮”果等，缩短植株经济寿命，降低产量和品质，造成巨大的经济损失。中国19个柑橘产生产省（市、自治区）中大多数收到该病害的威海，严重制约柑橘产业的健康发展。

柑橘黄龙病病原菌尚不能人工培养，目前普遍认为原核生物薄壁菌门变形菌纲（Proteobacteria）α-变型菌纲（Alphaproteobacteriacea）根瘤菌目（Rhizobiales)根瘤菌科（Rhizobiaceae）韧皮部杆菌属（‘CandidatusLiberibacter’）是引起黄龙病的主要病原菌，其病原菌分为亚洲种（‘Ca.L.asiaticus’）、非洲种（‘Ca.L.africanus’）和美洲种（‘Ca.L.americanus’），我国柑橘黄龙病病原主要是亚洲种（‘Ca.L.asiaticus’）。由于柑橘黄龙病尚无特效治疗性药剂，也没有抗（耐）病品种可供应用。因此，严格的检疫措施、种植无病苗木、及时挖除病树，以及系统而全面防治木虱是目前防治黄龙病较为有效的方法，而快速、稳定、灵敏的检测方法是无毒种苗生产的重要保证。

近年来，有报道证实基于PCR的方法已经成功用于HLB的检测，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR检测技术需要特殊的仪器设备且检测成本较高，而且它的检测时间仍然比较长（2～3小时），不适合田间大规模的快速应用。因此，在加强柑橘苗木检疫监测中，迫切需要开发一种灵敏度高、操作简便、成本低廉且结果判断迅速的检测方法，在一定程度上可以取代PCR的检测方法。

日本学者Notomi等于2000年首次开发了环介导等温核酸扩增反应（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP），该技术依赖六条特异引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，该技术先利用两条内引物和两条外引物，通过链置换作用形成茎环状DNA结构，然后在内引物的作用下通过环介导的自动循环链置换反应大量扩增靶序列，具有特异性强、敏感性高、简便易行等特点。实时荧光核酸恒温扩增检测技术（real-timefluorescenceloop-mediatedisothermalamplificationassay，简称RealAmp）是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，可以定量检测病原物，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点。此外，SYBRGreenI是目前LAMP产物最灵敏的检测方法之一，但是在RealAmp中SYBRGreenI的加入可能会抑制LAMP的反应效率，因此，在实际操作中普遍采用SYTO-9荧光染料进行RealAmp反应，而把SYBRGreenI染色颜色判断结果作为定量检测的一种辅助判断措施。

该方法通常是按如下步骤进行：步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA；步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、实时荧光核酸恒温扩增（RealAmp）反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63℃保温1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。

目前，国外Okudaetal.(2005)黄龙病亚洲种的tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB基因建立了HLB亚洲种的LAMP检测技术，其检测灵敏度能够检出大约300个基因拷贝，并对日本和印度尼西亚的HLB进行了检测分析。在国内，黄丽等（2012）采用核糖体的外膜蛋白基因（Genebank登录号：AY842429）建立HLB的LAMP快速检测方法，质粒DNA拷贝数为3.9×10¹的模板仍然可以有效扩增，比Okudaetal.(2005)的LAMP检测灵敏度更高，作者推测可能是引物扩增效率以及反应体系优化的结果。孔德英等（2013）同样采用核糖体的外膜蛋白基因（Genebank登录号：HQ2627229.1）为靶标建立了亚洲种的LAMP检测方法，其灵敏度可达25pg/μL，与对照实时荧光PCR方法灵敏度相同。