[发明专利]一种实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法

权利要求书

1.一种实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法，其特征在于，该实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法步骤如下：

步骤一、对被检样品进行预处理，提取DNA，取老熟叶片中脉近叶柄处5mg～10mg置于1.5mL离心管中，在液氮中研磨至粉末状后加入60μLTES缓冲液，70℃恒温水浴7min后再加入60μL酚:氯仿:异戊醇混合液，混合液中酚:氯仿:异戊醇的重量比为25:24:1，涡旋混匀后12000rpm离心5min，取40μL上清液加入由SephadexG-50-80构成的微柱中，4℃、5000rpm离心4min，用一新的无菌1.5mL的离心管收集滤液，-20℃保存备用；

步骤二、根据HLB16SrDNA保守序列设计出2对特异性引物，包含内侧引物HLB-F3、HLB-B3和外侧引物HLB-FIP、HLB-BIP各一对，制备特异性引物；

步骤三、荧光核酸恒温扩增检测反应；将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63℃保温90min进行循环链置换反应；

步骤四、荧光核酸恒温扩增检测标准曲线的构建；采用HLB亚洲种特异性PCR引物OI1和OI2c，引物扩增的的rDNA序列包含整个RealAmp的扩增区间，克隆序列到pMD18-T载体测序正确后的质粒，命名为pMD18-T-HLB，用于构建标准曲线；

HLB的PCR检测反应体系的方法：2.5μL10×PCRbufferMg2+，2μLdNTPs（2.5mMeach），0.25μLTaq聚合酶（5U/μL），引物OI1（5′-GCGCGTATTTTATACGAGCGGCA-3′）和OI2c（5′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3′）各1μL（10pM），1μLDNA，补水至25μL；PCR反应的条件：94℃预变性3min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延长90s、进行35次循环；72℃延长7min，反应结束后，取5μL反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳后EB染色观察结果，PCR扩增条带切胶回收连接pMD-18-T载体后测序正确后，将质粒命名为pMD18-T-HLB10ng/μL，10倍梯度稀释后作为模板用于评估荧光核酸恒温扩增的检测灵敏度并构建HLB RealAmp的标准曲线；

步骤五、采用定量检测结果的判断，在ESE-QuantTubeScanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果，反应结束后瞬时离心将反应管内盖上的SYBRGreenI混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果。

2.如权利要求1所述的实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法，其特征在于，在步骤一中，DNA提取液包含：100mMTris-HClpH8.0、20mMEDTA pH8.0和2%w/vSDS。

3.如权利要求1所述的实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法，其特征在于，在步骤二中，由两对引物构成的引物混合液，其中HLB-F3即5′-GGCCTTAGGGTTGTAAAGC-3′和HLB-B3即5′-CACCTCTACACTCGGAATTC-3′为外侧引物，HLB-FIP即5′-GGCTGCTGGCACGAAGTTACGCCGGAGAAGATAATGAC-3′和HLB-BIP即5′-GCGAGCGTTGTTCGGAATAACGTTGAGCCCTGGGATTTC-3′为内侧引物，外引物HLB-F3和所述外引物HLB-B3的浓度分别为5pmol/μl；内引物HLB-FIP和内引物HLB-BIP的浓度均为40pmol/μl。