[发明专利]提高热纤梭菌纤维素酶活的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物培养和发酵工程领域，具体是一种提高热纤梭菌纤维素酶活的培养方法。

背景技术

能源和环境危机是全世界都面临的重大难题，是目前各国的研究的热点问题。生物资源的能源化开发利用对于解决能源短缺、粮食危机和减少CO₂气体排放有极其深远的意义(Tilman et al，2009；Regalbuto et al，2009)。生物乙醇是目前开展的有前景的可替代能源，但是目前多采用粮食发酵，由于人口膨胀和粮食危机，淀粉乙醇受到诸多限制。

在我国，每年秸秆类农业废弃物产量多达7亿吨以上，是资源量最大，利用潜力最高的一类物质，具有巨大的生物质转化潜力。将秸秆类农业废弃物生物质转化为能源的过程，其限速步骤是纤维素的水解，特别是高度有序结晶的不溶性纤维素水解。早期对纤维素可再生能源的开发利用中主要利用好氧微生物产生纤维素酶，国内外研究主要集中在真菌(特别是瑞氏木霉)等。近年来，厌氧微生物降解纤维素的高效特性引起了广泛的注意(Tracy et al，2011)，由厌氧微生物产生的纤维素酶以胞外复合体的形式存在，被称之为“纤维小体”。 纤维小体主要包括：外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶和其他半纤维素酶。

热纤梭菌是一种高温、厌氧、纤维素降解菌。生长温度在50-70℃。可利用纤维素和半纤维素产生纤维二糖，木糖和木聚二糖等，还可产生乙醇、乙酸、乳酸、H₂和CO₂。目前研究发现热纤梭菌，热纤梭菌主要利用六碳糖（葡糖糖）作为能量来源，不能利用五碳糖（木糖），因而培养热纤梭菌的底物通常是纤维二糖、微晶纤维素和纤维素粉等。热纤梭菌是目前已获得的微生物中每毫克分泌蛋白的酶活性最高的纤维素降解菌(Lynd, 2002)，具有巨大的研究价值和实际应用潜力。

对热纤梭菌的研究是国内外的热点，目前研究主要集中在热纤梭菌的复合酶即“纤维小体”的结构和降解机制等方面。也有对不同碳源下微生物的生理生化变化和纤维小体的组分变化等方面的基础研究。但是没有涉及利用多种碳源合理搭配提高热纤梭菌纤维素酶活的培养方法。

工业发酵应用中，主要利用热纤梭菌产生的纤维小体对纤维素进行降解，因而提高热线梭菌的纤维素降解效率对于促进工业应用具有重要的意义。目前通用的适用于菌种保藏和发酵培养的方法，主要功能在于为热纤梭菌的生长和传代提供良好的培养基。例如，中国专利号“201110189094.8”公开了一种热纤梭菌高密度培养的方法，公开日为2013年01月09日。但是对工业发酵来说，对于热纤梭菌的纤维素酶活性没有特别的功效。

发明内容

本发明的目的在于克服现有解决热纤梭菌的纤维素酶活性存在的上述问题，提供一种提高热纤梭菌纤维素酶活的培养方法。采用本发明发酵液纤维素酶活力可以显著提高。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种提高热纤梭菌纤维素酶活的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、将菌种（clostridium thermocellum）DSM1237T（冻干粉保藏）配制成一级菌种液；

b、将一级菌种液加入到基础培养基中，菌种液与基础培养基的体积比为1：10至1：20，发酵培养48-72小时，成为二级菌种液；

c、将培养后的二级菌种液加入到配制的发酵培养基中，二级菌种液与发酵培养基的体积比为1：30~1：10；

d、发酵培养：温度50~70℃，厌氧，压力-0.1MPa~0.1MPa，静置，pH值6.5~8.0，培养时间为48~72h。

所述步骤b中的基础培养基为：硫酸铵1.30 g/L，氯化镁2.60 g/L，磷酸二氢钾1.43 g/L，磷酸氢二钾5.50 g/L，氯化钙 0.13 g/L，硫酸铁1.10 mg/L，半胱氨酸0.25 g/L，酵母膏 4.50 g/L，刃天青 1.0 mg/L， 微晶纤维素10.00 g/L或纤维二糖5.00 g/L。

所述步骤c中配制的发酵培养基为：硫酸铵1-2 g/L  氯化镁2-3 g/L，磷酸二氢钾 1-2 g/L，磷酸氢二钾 5-6g/L，氯化钙0.1-0.3 g/L，硫酸铁 1-2 mg/L，半胱氨酸0.2-0.5 g/L，氮源 4-6 g/L，刃天青 1.0 mg/L，碳源10.0-12.0 g/L。

所述发酵培养基在配制时，灭菌前调节pH到7.0，121℃灭菌 30分钟。