[发明专利]一种大黄鱼原肌球蛋白基因及其重组蛋白与应用

权利要求书

1.大黄鱼原肌球蛋白基因，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO.1基因序列。

2.如权利要求1所述大黄鱼原肌球蛋白基因的克隆方法，其特征在于包括如下步骤：

1)从大黄鱼的肌肉组织中提取总RNA；

2)进行cDNA第一链合成；

3)根据其它鱼类Tropmyosin的保守序列设计引物进行PCR反应，得到原肌球蛋白（Tropmyosin）基因片段，其中：

正向引物F1：5’CCAGTTGGTKGAGGAGG3’；

反向引物R1：5’GWGTAGTCATRTCGTTG3’；

4)用2条基因特异性正向引物：

F2：5’CGCGCTCAGGAGAGACTG3’；

F3：5’GAAGGTGATCGAGAACAG3’；

进行原肌球蛋白（Tropmyosin）基因cDNA3’端快速扩增（3’RACE）；

5)用2条基因特异性反向引物：

R2：5’CTACAGAGTAGTCATGTC3’；

R3：5’TTCAGCTGCATCTCTTGG3’；

进行对原肌球蛋白（Tropmyosin）基因cDNA5’端快速扩增（5’RACE）。

3.大黄鱼原肌球蛋白的GST重组蛋白，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

4.如权利要求3所述大黄鱼原肌球蛋白的GST重组蛋白的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

1)用2条特异性引物：

正向引物F4：5’CGGAATTCATGGAGGCCATCAAGAAG3’(斜体表示EcoRI的酶切位点)；

反向引物R4：5’CCGCTCGAGCTACAGAGTAGTCATGTC3’(斜体表示XhoI的酶切位点)；扩增原肌球蛋白（Tropmyosin）基因的开放阅读框；

2）插入表达载体pGEX-4T-2的EcoRI和XhoI多克隆位点间；

3)将构建好的重组表达载体pGEX-4T-2-Tropmyosin转入表达菌株BL21(DE3)进行IPTG诱导表达；

4）用Glutathione Sepharose4B亲和层析纯化GST-Tropmyosin融合蛋白。

5.如权利要求1所述大黄鱼原肌球蛋白基因在制备提升大黄鱼抗病力药物中的应用。