[发明专利]将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离

说明书

技术领域

本发明涉及精子的分离技术领域，具体而言，涉及将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离。

背景技术

流式细胞仪分离动物X精子和Y精子,是动物性别控制的一条新途径，其工作原理是：利用动物含有X染色体和含有Y染色体的精液中DNA含量存在差异，借助荧光染料染色，然后根据发出的荧光强度，通过计算机判别精子类别，再通过给精液液滴附加电荷，根据静电原理，将含有X染色体的精液和Y染色体的精液分离。

在相关技术中，上述方法常用的荧光染料易发生聚集荧光猝灭现象：当染料的浓度较高时，染料分子会聚集进而导致发射的荧光强度骤降。当待分离的精液密度较高时，此时需要较高浓度的荧光染料进行标记，但是高浓度的染料分子会发生聚集，进而发生聚集荧光猝灭，导致精子的分离效果不理想。

发明内容

本发明的目的在于提供将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，包括下列步骤：

向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液，再孵育，得到混合液；其中，所述荧光染料为四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯，并且所述待分离的精液中每含4亿个精子时，至少加入7μg所述荧光染料；

采用流式细胞仪对所述混合液进行分离，得到分离的X精子和Y精子。

本发明上述实施例的将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，所用的荧光染料—四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯（即TTAPE）是一种具有聚集诱导发光现象的分子，即当荧光染料浓度较大或者聚集时，荧光染料分子内旋转被冻结或者形成聚集体使其荧光发射显著增大，其灵敏度高、背景噪音低。因而当待分离的精液密度较高需采用高浓度的荧光染料时，也不会发生荧光猝灭的现象，从而避免了对分离效果的不利影响。其中，TTAPE在本发明的应用中发射荧光的原理是：TTAPE与DNA的静电相互作用而结合，由于与DNA的结合，限制了分子间转动，致使其发荧光。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。

实施例一

该实施例提供了将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，包括下列步骤：

第一步：向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液（staining talp），再孵育，得到混合液。

第二步：采用流式细胞仪对混合液进行分离，得到分离的X精子和Y精子。

其中，荧光染料为四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯，并且待分离的精液中每含4亿个精子时，至少加入7μg荧光染料。

以上应用所用的荧光染料为四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯（即TTAPE），其是一种具有聚集诱导发光现象的分子，即当荧光染料浓度较大或者聚集时，荧光染料分子内旋转被冻结或者形成聚集体使其荧光发射显著增大，其灵敏度高、背景噪音低。因而当待分离的精液密度较高需采用高浓度的荧光染料时，也不会发生荧光猝灭的现象，从而避免了对分离效果的不利影响。由此可见，TTAPE可替代现有技术中用于分离精子的其它染色体，采用一种新型的发光原理—聚集诱导发光进行检测。

另外，上述应用还具有另外的一个优点：由于TTAPE在光源的照射下不会发生猝灭现象，因此上述应用中的所有步骤不需要在避光条件下操作。由此可见，本发明的应用降低了对操作条件的要求，更易推广。

其中，TTAPE在本发明的应用中发射荧光的原理是：TTAPE与DNA的静电相互作用而结合，由于与DNA的结合，限制了分子间转动，致使其发荧光。

上述应用中所用的荧光染料TTAPE通常采用如下的制备方法：

第一步：DHBP(4，4’二羟基二苯酮)3克和碳酸钾5克，50mL丙酮加入到4mL1，2-二溴乙烷中，将混合物以回流方式搅拌、加热24小时，过滤，蒸干溶剂。粗产物用硅胶柱（氯仿）得到4，4’-二羟基苯丙酮（BBEBP）白色粉末。产物经过红外和核磁测试的验证。