[发明专利]貉源性成分检测用引物和探针及其检测方法

说明书

技术领域

 本发明涉及动物源性成分的检测，具体涉及一种貉源性成分检测用引物和探针及其检测方法。

背景技术

貉的养殖规模不断扩大，貉的毛皮制品很有市场，同时，貉的养殖量很大，貉单只的个体大，作为貉毛皮产业的副产物，貉肉往往被添加到食品或者饲料中，因此，提供一种能够快速准确检测貉源性成分的方法十分必要。传统感官方法鉴定貉源性成分，依据色泽、气味、组织性状等进行判断，容易受主观因素影响，而且需要经验的积累，尤其是添加了色素、芳香剂以及受到深度加工的制品，更增加了鉴定难度以及监控监管的风险性。目前，仍然没有从基因水平对貉源性成分进行鉴别鉴定的检测方法，在毛皮制品、食品及饲料中貉源性成分检测应用上存在空白。基于遗产物质DNA实时荧光PCR技术已经成功应用在一些常见家畜家禽物种中，如牛，马，鸡等，技术条件成熟。物种特异基因序列，为一段只有目标检测生物物种所特有的遗传信息，通过寻找比对貉与其他物种的遗传基因序列，查找貉的特异基因，获得遗传DNA序列信息，在此基础上设计引物、探针，能够区分出不同物种来源的样本，使得含有貉源性成分的样本产生特异扩增荧光信号，从而对貉源性成分进行鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种貉源性成分检测用引物和探针及其检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种貉源性成分检测用引物和探针：

上游引物序列为：5’-TACAGCTGATCTCCTCACGTTAACA-3’；

下游引物序列为：5’-TTGGCCGATGATGATGAAAG-3’；

探针序列为：5’- AATTGCAGGCCAACCGGTCGAAC-3’，其5’端标记FAM 报告荧光基团，3’端标记TAMRA 淬灭荧光基团。

一种应用上述貉源性成分检测用引物和探针进行貉源性成分检测的方法，包括如下步骤：

（1）提取样品DNA：取吸脂烘干并研磨成细粉的样品100mg放入2mL离心管中，加入CTAB提取液600μL和蛋白酶10μL，65℃水浴加热1小时，分别加入Tris饱和酚、氯仿异戊醇各400μL分别摇匀，离心取上清加入1.5mL离心管中，加入该上清量2倍体积的CTAB沉淀液，室温静置1小时，离心弃上清，先加入氯化钠水溶液400μL摇匀溶解沉淀，再加入400μL氯仿摇匀，离心取上清，加入新的1.5mL离心管中，加入该离心管中上清量0.8倍体积的异丙醇摇匀静置1小时，离心弃上清，加入1000μL的70％酒精洗涤，离心，静置晾干，溶于100μL水中；

（2）进行实时荧光PCR 检测：实时荧光PCR 检测的反应体系为25μL：包括12.5μL 含有dNTP、Mg²⁺ 以及Taq 酶的2×real time PCR Buffer；所述的上游引物和下游引物各1μL，终浓度为0.2μM；所述的探针1μL，终浓度为0.2μM；步骤（1）提取的样品DNA 模板2μL；纯水7.5μL；实时荧光PCR 检测的反应程序为：预变性：温度95℃，时间10分钟，然后进行PCR扩增：温度95℃，时间15秒，温度60℃时间1分钟，循环45 次。

本发明的有益效果在于：根据貉的物种特异基因序列设计用于实时荧光PCR 检测的引物和探针，同时对样品前处理、PCR扩增体系条件等做了优化，提供了一种貉源性成分的实时荧光PCR 检测方法，可准确、快速鉴定貉源性成分，能够有效抵御假冒动物源性成分产品掺假，在食品、饲料以及皮毛类产品的鉴定上具有很大的实用价值。同时对于经动物貉传播的某些疾病也可通过该方法鉴定其成分，并控制其进出境，来防止这些疾病病原的传播与蔓延。

本发明通过优化改良了样品前处理DNA提取方法，可以有效减少所提取DNA中的杂质干扰，DNA纯度更高，提高了检测的灵敏度，比商业化的试剂盒更为经济。针对引物和探针序列采取的PCR扩增体系也保证了检测的特异性与灵敏度。

本发明针对貉的物种特异遗产物质DNA的PCR分子鉴定技术，具有特异性高、针对性强、灵敏度高、简便快速、对检测样品要求低的特点，能够准确客观的提供实验证据。

附图说明

图1为貉源性成分实时荧光PCR 检测方法特异性实验图；

图2为貉源性成分实时荧光PCR 检测方法灵敏性实验图。

具体实施方式

结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例：

（1）、实时荧光PCR 检测方法特异性引物的设计