[发明专利]一种用于β-地中海贫血β17(A→T)点突变的检测试剂盒及ARMS-QPCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于β-地中海贫血β17(A→T)点突变的检测试剂盒及ARMS-QPCR检测方法，属于分子生物学领域。

背景技术

β地中海贫血(β-mediterranean anemia)是指β链的合成受部分或完全抑制的一组血红蛋白病。患儿出生时无症状，多于婴儿期发病，生后3~6 个月内发病者占50%，偶有新生儿期发病者。发病年龄愈早，病情愈重。严重的慢性进行性贫血，需依靠输血维持生命，3~4 周输血1 次，随年龄增长日益明显。

因本病多为点突变，故常用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，PCR）加等位基因特异性寡核苷酸杂交法（allele-specificoligonucleotide，ASO）才能明确突变点，我国各民族的β地中海贫血基因突变情况有一定差异，南方汉族的突变基因以CD41-42（-TCTT）、CDL7（A→T）、IVS-Ⅱ-654（C→T）和TATA-box28（A→G）为主，占85%~90%。双重杂合子的突变组合可达近100 种，β-地中海贫血β17 (A→T)是众多β-地中海贫血突变位点中的一种，约占14%，它是由于17位碱基突变导致终止密码子TAG的形成，使β链不能合成。

扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS），又名等位基因特异PCR（allele specific  PCR ，ASPCR）， 是验证性检测DNA序列变化的经典方法之一，典型的ARMS过程包含两个PCR扩增过程，引物有两对，它们的区别在于3’端不同，一条引物能与“正常”的靶DNA互补，另一条与“非正常”的靶DNA互补，因此两个扩增反应只能扩增“特定”的DNA模板，因此要求3’末端核苷酸必须等位特异。

目前对该β-地中海贫血检测方法一般是采用PCR-反向点杂交法（Polymerase Chain Reaction -Reverse Dot Blot，PCR-RDB），该法是将特异的探针分别固定到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再将经PCR特异性扩增的产物（在PCR引物5’端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素）与之杂交，这样待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。这种以膜上固定探针取代固定靶DNA的方式，一次杂交反应可以检测多种靶序列，但是该法的基因检测技术需明确α、β珠蛋白基因的异常位点，检测时间长，检测灵敏度低，而且操作繁琐，不适用于大样本量的检测等缺点，基因检测技术需要送到专门检验单位去检查，费时费力。

实时荧光定量PCR检测在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用，其基本原理为：在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，见图1，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种检测灵敏度高，且能安全、快速检测的用于β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的检测试剂盒并提供一种方法简单，误差小，准确度高，灵敏度高的一种用于β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的ARMS-QPCR检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种用于β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的检测试剂盒，其特征在于：包括PCR反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ、混合酶液、DNA提取液、阴性对照液和阳性对照品；

所述PCR反应液Ⅰ包括上游引物Ⅰ、探针和下游引物；

所述 PCR反应液Ⅱ包括上游引物Ⅱ、探针和下游引物；

所述混合酶液包括DNA聚合酶、灭菌超纯水Ⅰ和显色液；

所述DNA提取液包括苯酚和氯仿；

所述阴性对照液为不含有β-地中海贫血β17 (A→T)基因的Tris-EDTA缓冲液，浓度为0.01M~0.015M，pH为8.00~8.02；

PCR反应液Ⅰ用于扩增出野生型阳性DNA模板；

PCR反应液Ⅱ用于扩增出突变型阳性DNA模板；

所述上游引物Ⅰ3’位末端碱基为A，所述上游引物Ⅱ3’位末端碱基为T；