[发明专利]一种用于β-地中海贫血β17(A→T)点突变的检测试剂盒及ARMS-QPCR检测方法

权利要求书

1.一种用于β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的检测试剂盒，其特征在于：

PCR反应液Ⅰ包括上游引物Ⅰ、探针和下游引物，用于扩增出野生型阳性DNA模板；

PCR反应液Ⅱ包括上游引物Ⅱ、探针和下游引物，用于扩增出突变型阳性DNA模板；

所述上游引物Ⅰ3’位末端碱基为A，所述上游引物Ⅱ3’位末端碱基为T。

2.根据权利要求1所述的一种用于β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的检测试剂盒，其特征在于：所述上游引物Ⅰ、上游引物Ⅱ、探针和下游引物的序列分别为：

上游引物Ⅰ：5’-TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCA-3’；

上游引物Ⅱ：5’-TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCT-3’；

探针：5’-(FAM) GGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGT(DABCYL)-3’；

下游引物：5’-ACCCAAGAGTCTTCTCTGTCTCCACAT-3’。

3.根据权利要求1所述的一种用于β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的检测试剂盒，其特征在于：试剂盒还包括混合酶液、DNA提取液、阴性对照液和阳性对照品，所述混合酶液包括DNA聚合酶、灭菌超纯水Ⅰ和显色液，所述PCR反应液Ⅰ和PCR反应液Ⅱ均还包括灭菌超纯水Ⅱ、缓冲液、氯化镁和dNTPs。

4.根据权利要求1或3所述的一种用于β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的检测试剂盒，其特征在于：所述灭菌超纯水Ⅱ、缓冲液、氯化镁、dNTPs、上游引物Ⅰ、上游引物Ⅱ、下游引物、探针、DNA聚合酶、灭菌超纯水Ⅰ和显色液含量如下：

灭菌超纯水Ⅱ   体积为11.4～4.8 μl /管；

缓冲液         浓度为5~15×Buffer       体积为2～4 μl /管；

氯化镁         浓度为20~30 mM        体积为2～4 μl /管；

dNTPs          浓度为2.0~3.0mM       体积为2～4 μl /管；

上游引物Ⅰ      浓度为30~100 μM     体积为 0.1～0.2 μl /管；

上游引物Ⅱ      浓度为30~100 μM     体积为 0.1～0.2 μl /管；

下游引物        浓度为30~100 μM     体积为0.1～0.2 μl /管；

探针            浓度为30~100 μM     体积为0.06～0.2 μl /管；

DNA聚合酶     浓度为3~10U/ul       体积为0.15～0.3μl /管；

显色液          体积为 0.01～0.02μl /管；

灭菌超纯水Ⅰ    体积为1.84～1.68 μl /管。

5.根据权利要求1所述的一种用于β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Taq酶，所述显色液为溴酚蓝。

6.根据权利要求1所述的一种用于β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的检测试剂盒，其特征在于：所述DNA提取液的提取方法为苯酚-氯仿抽提法。

7.一种用于β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的ARMS-QPCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

样品采集：以β-地中海贫血的合成DNA模板为检测样本；

样品处理：将待检β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的DNA模板使用苯酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA，获得DNA样品；

样品检测：将获得的DNA样品进行荧光定量PCR检测，荧光定量PCR检测步骤中使用一种用于β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的检测试剂盒。

8.根据权利要求7所述的一种用于β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的ARMS-QPCR检测方法，其特征在于：所述PCR反应的反应条件为：50~55℃反应2~5min，94~95℃反应2~3min，94~95℃反应5~10s，55~60℃反应40~80s，35~39个循环。

9.根据权利要求7或8所述一种用于β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的ARMS-QPCR检测方法在一种用于β-地中海贫血β17 (A→T)点突变的检测试剂盒中的应用。