[发明专利]异种角膜材料的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学领域,更具体地说，它涉及一种能直接应用于板层角膜移植的异种材料的制备方法。

背景技术

角膜位于眼球前壁的一层透明膜，约占纤维膜的前1/6，从后面看角膜呈正圆形，从前面看为横椭圆形。角膜是眼睛最前面的透明部分，覆盖虹膜、瞳孔及前房，并为眼睛提供大部分屈光力，加上晶体的屈光力，光线便可准确地聚焦在视网膜上构成影像。

同时，因角膜透明性丧失而导致的角膜盲是仅次于白内障的引起视力丧失的主要原因。眼外伤和角膜溃疡每年使150 万～200 万的人们失明。对于这种失明唯一有效的治疗是移植人类供体角膜( 也称作“角膜移植术”)。

目前，市场上角膜材料的短缺和需求之间的巨大差距，在异体角膜如此缺乏并短期内难以改变的情况下，人们只能通过寻找各种方法来研制可替代的新材料来解决角膜的短缺问题。

已经报道并通过验证的新材料主要包括生物材料和异种角膜材料。按照现有的报道，生物材料的组织相容性差，尚不能在广泛应用；相比较而言，异种角膜材料具有更广阔的应用前景。目前的技术主要集中于使用蛋白酶（胰蛋白酶）或磷酸脂酶A2等化学方式去除异种角膜中的细胞。

问题是这些酶类也会对胶原结构产生影响，对移植后的角膜细胞的长入也有一定的抑制作用，以往文献也发现移植后早期的植片混浊是异种角膜材料主要的弊端，故上述的具体处理方法和制备方法还有较大的空间去优化。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种异种角膜材料的制备方法，该方法能够制备出透明性极高、低免疫原性、生物活性和生物相容性好的异种角膜材料，且保持胶原三维结构与新鲜角膜相近，并通过胶原交联进一步降低胶原的抗降解性和免疫原性。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案,处理步骤应依次为：

一、处理：在动物死亡后四个小时内获取可作为异种角膜材料的眼球，依次用浓度为2%的碘伏和浓度为0.9%的生理盐水来冲洗整个眼球，然后剪除眼球周围的筋膜肌肉，接着用浓度为2%的碘伏冲洗整个眼球，冲洗完后再用浓度为0.9%的生理盐水冲洗整个眼球；

二、灭菌：将整个眼球泡入含有40 mg妥布霉素的50%高糖溶液10ml中，泡的时间为至少20 分钟，20 分钟后用浓度为0.9%的生理盐水对整个眼球进行冲洗；

三、细胞失活：将整个眼球转入溶液中密封保存，保存过程中逐渐降温，每分钟降温2-3℃，最终在-78℃的温度下进行长期保存，所述保存期限至少为4周，所述溶液包括甘油和缓冲溶液，其中甘油浓度为85%至95%，缓冲溶液浓度为5～15%；

四、灭病毒：将已经经过密封保存的整个眼球转至-20℃的保温容器中，用γ射线进行辐照，辐照剂量为25kGy；

五、交联：将经过辐照的整个眼球转至含有20%至80%甘油的交联剂中，在4℃的温度下保存1至72小时，交联剂选自 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，它们之间的质量比为1:1至3:1；EDC在溶液中最终浓度为1.0%至10.0%；

六、植片制作：将经过交联的整个眼球取出，放于林格氏液中清洗2次，每次5分钟，清洗完成后沿眼球角膜缘后2毫米剪开，植片于角膜板层切削器中，切削器对角膜的切削厚度为200μm 至550μm。

本发明制备异种角膜材料的方法主要有四大特点。

第一个特点是使用全眼球保存，使用全眼球保存具有以下优点：1、在步骤三中全眼球保存有效地保持了角膜胶原纤维中的三维结构和角膜固有形态；并且甘油对角膜的脱水过程更加温、缓慢和均匀，从而使胶原纤维的三维结构免受快速而强烈脱水的破坏；2、在步骤五中全眼球交联，在一定浓度的甘油保存下，眼球处于无脱水状态，有效的维持角膜的原始形态、厚度、曲率，角膜胶原纤维的构建和排列与新鲜角膜最为接近，在此状态下进行全眼球交联，有效控制交联的速度和强度，并在最接近角膜固有形态的条件下进行缓慢而均匀的交联，交联后能有效保存角膜形态和胶原纤维构象。上述原因使全眼球保存可以获得与新鲜角膜更为接近的角膜形态、胶原纤维构象，从而获得更为透明的角膜板层材料。