[发明专利]一种α-芋螺毒素MI的全固相合成方法

说明书

技术领域

本发明属于多肽药物合成技术领域，特别涉及一种含多对二硫键的芋螺毒素MI的全固相合成方法。

背景技术

芋螺毒素是从热带海洋软体动物芋螺中得到的一类具有生物活性的多肽毒素，能特异性地作用于动物体内各种离子通道及受体，已在神经科学研究领域和新药研制方面受到了前所未有的广泛关注。芋螺毒素包括O-、M-、A-、S-、T-、P-、Y-等多个超家族，其中A超家族的α-芋螺毒素是芋螺毒素家族中的一类重要成员，能特异地作用于乙酰胆碱受体（nAChRs）各种亚型，对疼痛、成瘾、抑郁症、帕金森氏病、肌肉松弛等具有潜在的药用价值。α-芋螺毒素的作用靶点为神经肌肉接头的N乙酰胆碱受体（nAChRs），表现出对动物的麻痹和致死作用，乙酰胆碱受体（nAChRs）属于配门控通道，对诸如学习和记忆等神经生理过程起着至关重要的作用；对于阿尔茨海默病、帕金森症以及精神分裂、癫痫、肌无力等病症的病理生理研究和治疗，AChRs的意义则更为重要。通过对与nAChRs的不同亚型专一性结合的配体的研究，将为新药的研发提供十分有意义的线索。另外，α-芋螺毒素能结合并阻断小细胞肺癌细胞表面的nAChR，在小细胞肺癌的诊断和治疗中也有潜在的应用价值。

α-芋螺毒素结构中肽链（Cys残基排列方式-CC-C-C-）短小，半胱氨酸含量高，多数有两对二硫键，少数有三对二硫键，除SⅡ型α-芋螺毒素外，C端均是酰胺化的。二硫键的正确形成对α-芋螺毒素的毒性至关重要。

α-芋螺毒素MI是从幻芋螺毒液中提取出的一种小肽，长度为14个氨基酸，二硫键结构模式为C3-C8；C4-C14（氨基酸序列式如下所示），作为一种阻断剂，能特异性地与哺乳动物肌肉型nAChRs的α₁δ亚基结合。α-芋螺毒素MI的结构如下：

专利CN102875653A报到了固相合成线性肽，然后再在液相中成环的方法。该方法先用固相合成仪合成了芋螺毒素的线性肽，切除固相上全保护的线性肽，再将得到的产物进行氧化折叠。并且该方法中，4个半胱氨酸的巯基全部都是用Trt保护，在氧化折叠过程中使该方法不具备选择性形成两对二硫键，难以合成正确结构的α-芋螺毒素。

专利CN102875654A报到了芋螺毒素多肽Eb1.6的制备方法。其方法同样也是先在固相上合成线性肽，再在缓冲液中氧化折叠形成芋螺毒素多肽Eb1.6。同样，该方法中的4个半胱氨酸的巯基也都是用Trt保护，在氧化折叠过程中使该方法不具备选择性形成两对二硫键，难以合成正确结构的芋螺毒素多肽Eb1.6。液相中成环需要高度稀释以防止分子间的二硫键的形成，因此增加后处理的难度，降低生产效率，无法满足大规模的工业化生产要求。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种含多对二硫键的芋螺毒素MI的固相合成方法。

技术方案：本发明提供的一种α-芋螺毒素MI的全固相合成方法，包括以下步骤：（1）按照固相合成的方法，Fmoc氨基树脂在Fmoc脱保护试剂作用下反应脱去Fmoc后，在偶联体系作用下于偶联溶剂中从C端到N端依次依肽序依次连接Fmoc氨基酸，合成十四肽氨基树脂，所述十四肽树脂为PG-Gly-Arg-Cys(X₂)-Cys(X₁)-His-Pro-Ala-Cys(X₂)-Gly-Lys-Asn-Tyr-Ser-Cys(X₁)-氨基树脂，或为PG-Gly-Arg-Cys(X₁)-Cys(X₂)-His-Pro-Ala-Cys(X₁)-Gly-Lys-Asn-Tyr-Ser-Cys(X₂)-氨基树脂；其中，PG为Fmoc或Boc，X₁为Trt或Mmt，X₂为Acm；

（2）在氧化体系的作用下，十四肽氨基树脂反应脱除X₁和X₂；

（3）步骤（2）产物在脱除N端保护基后，在裂解体系作用下裂解脱除侧链保护基，即得α-芋螺毒素MI。

上述α-芋螺毒素MI的α-芋螺毒素MI的全固相合成方法流程如下：（其中，第3位和第8位Cys上的保护基为X₂，第4位和第14位的Cys上的保护基X₁，X₁=Trt或Mmt，X₂=Acm）：