[发明专利]核桃乳饮品中大豆、花生成分的双重PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于食品质量安全监测技术领域，具体地说涉及应用双重PCR法对核桃乳饮品中掺入的大豆、花生成分的同时快速检测方法 。

背景技术

随着人们生活水平的日益提高，对保健营养食品的需求越来越大；随着人们消费意识的转变，追求“营养、安全、健康”的消费意识也更加浓厚。核桃是一种营养丰富的食品原料，不含胆固醇，含有丰富的核黄素、卵磷脂、微量元素、维生素、氨基酸及大量不饱和脂肪酸，可以防止机体早衰、促进脑细胞发育、减少胆固醇的合成、防止动脉硬化，是一种理想的营养保健食品。而核桃蛋白中含有对人体有益的多种氨基酸成分，核桃乳饮料凭借其健康、营养、安全、时尚的优势得到迅猛发展，核桃乳饮品的产业化发展令人瞩目，市场前景十分广阔。在以核桃为主要成分的食品未加工前，根据形态很容易将核桃和其他物种进行鉴别，但在食品加工处理后，往往失去直观的可鉴别特征。不法商家为追求眼前利益，采用价格相对低廉的大豆、花生仿造核桃乳饮料，以次充好并以低价争抢市场，严重侵害了消费者的合法权益，甚至给消费者的健康安全带来威胁，也严重影响了核桃产业的健康发展。目前核桃乳（露）执行的检测标准，以物理和化学法检测核桃乳的感官和各种理化值，如：蛋白质、脂肪等，虽能对其作出初步判断，但理论依据不充分，不能适应现今社会发展的需要。在文献报道及国家相关植物蛋白饮料标准中，都没有同时对核桃乳中掺入大豆、花生蛋白进行快速鉴别的有效方法。

目前国内对含核桃成分食品中核桃蛋白成分的鉴定主要为以抗体-抗原特异性识别为基础的酶联免疫吸附（ELISA）检测，对于掺入常见低价蛋白如大豆、花生蛋白的DNA检测仍未见报道。由于在核桃乳的生产过程中，在饮品中有少量残留的原材料DNA，且DNA比蛋白稳定，所以PCR方法较ELISA方法更为准确，并且避免了对大量抗体的需求。本研究针对大豆、花生成分设计特异性引物，建立了运用双重PCR技术同时检测核桃乳中掺入大豆、花生成分的方法。

发明内容

针对上述情况，本发明克服了现有技术中的缺点，目的就在于建立一种运用PCR技术快速同时检测核桃乳中主要掺杂物质大豆和花生成分的方法，为各类核桃蛋白食品和保健品的中掺假成分的鉴别提供技术支持。为实现上述目的，本发明的方法为：针对大豆设计一组特异性引物Bd 28K-F和Bd 28K-R；针对花生设计一组特异性引物Arah1-F和Arah1-R；提取不同植物乳品的DNA，利用两对引物进行双重PCR扩增，对引物进行物种特异性的验证，观察是否有大豆特异性扩增条带（216bp）和花生特异性扩增条带（150bp）；提取不同核桃乳材料中的DNA，利用参照引物即植物通用引物（CP03-F、CP03-R）对所提取DNA进行PCR扩增，观察是否有123bp条带扩增，防止假阴性，利用所设计两对引物进行目的基因的PCR特异性扩增；对PCR扩增结果进行分析。

本发明技术内容包括：

（一）该方法使用大豆、花生特异性引物对不同植物乳饮品进行双重PCR检测：

大豆引物：

Bd 28K-F：5’-GCAGCATTGACCCCTCTACAAGC-3’，

Bd 28K-R：5’-TTCGAATCCAGAAAGCACCGAGT-3’，

花生引物：

Ara h1-F：5’-GCCATCAACGCTTCCTCCGAACTCC-3’，

Ara h1-R：5’-TTCACCCGACCCAGGGAATGCT-3’。

本发明中双重PCR反应体系中各组分构成比例如下：

成分                         加样量

2×Premix Taq (TaKaRa)          12.5μl

引物Bd 28K-F (10μM)          0.5μl

引物Bd 28K-R (10μM)          0.5μl

引物Ara h1-F (10μM)           0.5μl

引物Ara h1-R (10μM)           0.5μl

DNA样品                                  1.0μl

Rnase Free dH2O                           9.5μl

总体积                         25μl。

本发明双重PCR方法中扩增程序为：

（1）94℃    10min