[发明专利]双基因缺失的副猪嗜血杆菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌及其构建方法。 

背景技术

副猪嗜血杆菌病是近年来严重危害养猪业的新发细菌性传染病，引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜脑炎等，发病率一般为10-15%，死亡率可达50%以上，引起了人们的日益重视。该病的致病菌副猪嗜血杆菌（Hps）的血清型复杂多样，按Kieleetin.Rapp-Gbarideosn(KRG)琼脂扩散血清分型方法，至少可将Hps分为15个血清型，另有20%以上的分离株血清型不可定。己有的资料表明，Hps具有明显的地方性特征，基于某个或某些特定血清型菌株的全菌体制备的灭活疫苗在不同血清型之间所产生的交叉保护率很低，急待研制具有高效交叉保护力的疫苗。因此弱毒活疫苗的研制是当前多数传染病的研究热点。 

目前关于Hps的致病机理尚不清楚，aroA基因和omp2基因被认为是Hps的潜在毒力基因，在其它细菌中有较深的研究报道。aroA基因是细菌芳香族氨基酸代谢通路中一个非常重要的酶，该酶活性的缺失会导致细菌毒力降低等生物学变化，已被应用于多种细菌的缺失弱毒疫苗的构建。omp2在流感嗜血杆菌定殖中发挥重要作用，且已被证实与人的粘蛋白的特定成分结合，是细菌侵入机体过程中一个重要的因子。 

发明内容

本发明主要是利用现代基因工程原理和分子生物学手段对Hps潜在的毒力因子aroA基因和omp2基因进行缺失，构建Hps不含抗性标记的双基因缺失菌株，并对其生物学特性及致病力等进行探讨，为进一步研制新型高效可提供高交叉保护效力的基因工程活疫苗打下基础。 

本发明的目的在于提供一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌，构建一种副猪嗜血杆菌的变异株，用于制备预防副猪嗜血杆菌病灭活疫苗。 

本发明的另一目的在于双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法。 

本发明的又一目的在于双基因缺失的副猪嗜血杆菌在制备预防副猪嗜血杆菌病灭活疫苗中的应用。 

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下： 

一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌，其是菌株的aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸和omp2基因缺失181258-181643位核苷酸的双基因缺失株，菌株保藏号为：CCTCC NO:M2013460。该菌株于2013年9月29日由中国典型培养物保藏中心接受保藏，并于2013年10月9日检测存活，该菌株保藏名称为副猪嗜血杆菌GD-1;保藏中心地址为中国武汉，武汉大学，邮编为430072。 

一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其步骤如下： 

A）基因的克隆与重组自杀性质粒的构建：参照GenBank中aroA、omp2基因的序列，从H10中扩增了aroA和omp2基因的上下游片段。将得到的上下游片段，连接到携带蔗糖敏感基因(SacB)的自杀性质粒pEMOC2上，构建缺失了第394131-394631位核苷酸的aroA基因的重组自杀性质粒pEMΔaroA和第181258-181643位核苷酸的omp2基因的重组自杀性质粒pEMΔomP2； 

B）接合转移与副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建：以转化了上述重组自杀性质粒pEMΔaroA的大肠杆菌β2155为供体菌，血清5型菌株H10为受体菌进 行接合转移后，涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上，筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子，进行第一次PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中，鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生，涂布含10%蔗糖的平皿，并转印到Cm平皿上，筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆，并进行第二次PCR鉴定，确定发重组自杀性质粒已经丢失，从而构建出aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸的单基因缺失株HS02；