[发明专利]双基因缺失的副猪嗜血杆菌及其构建方法有效
| 申请号： | 201310518321.6 | 申请日： | 2013-10-28 |
| 公开（公告）号： | CN103865834A | 公开（公告）日： | 2014-06-18 |
| 发明（设计）人： | 贾爱卿;王贵平 | 申请（专利权）人： | 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 |
| 主分类号： | C12N1/20 | 分类号： | C12N1/20;C12N15/74;A61K39/102;A61P31/04;C12R1/21 |
| 代理公司： | 广州市越秀区哲力专利商标事务所(普通合伙) 44288 | 代理人： | 汤喜友 |
| 地址： | 510000 广东省广州市高新*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因 缺失 嗜血 杆菌 及其 构建 方法 | ||
1.一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌，其特征在于：其是菌株的aroA基因缺失第394131- 394631核苷酸和omp2基因缺失181258- 181643位核苷酸的双基因缺失株，菌株保藏号为：CCTCC NO: M2013460。
2.一种如权利要求1所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其特征在于，其步骤如下：
A）基因的克隆与重组自杀性质粒的构建：参照GenBank中aroA、omp2基因的序列，从H10中扩增了aroA和omp2基因的上下游片段；将得到的上下游片段，连接到携带蔗糖敏感基因(SacB)的自杀性质粒pEMOC2上，构建缺失第394131- 394631位核苷酸的aroA基因的重组自杀性质粒pEMΔaroA和缺失第181258- 181643位核苷酸的omp2基因的重组自杀性质粒pEMΔomp2；
B）接合转移与副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建：以转化了上述重组自杀性质粒pEMΔaroA的大肠杆菌β2155为供体菌，血清5型菌株H10为受体菌进行接合转移后，涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上，筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子，进行第一次PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中，鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生，涂布含10%蔗糖的平皿，并转印到Cm平皿上，筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆，并进行第二次PCR鉴定，确定发重组自杀性质粒已经丢失，从而构建出aroA基因缺失第394131- 394631 位核苷酸的单基因缺失株HS02；
C）副猪嗜血杆菌双基因缺失株的构建：用转化了上述重组自杀性质粒pEM?omp2的大肠杆菌β2155为供体菌，上述单基因缺失株HS02为受体菌进行接合转移后，涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上，筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子，进行第一次PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中，鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生，涂布含10%蔗糖的平皿，并转印到Cm平皿上，筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆，并进行第二次PCR鉴定，确定发重组自杀性质粒已经丢失，从而构建构建aroA基因缺失第394131- 394631位基因和omp2基因缺失181258- 181643双基因缺失的菌株。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：步骤B）接合转移与副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建过程中，第一次PCR鉴定时，所用的上游引物为SEQ ID NO:5，下游引物为SEQ ID NO:6；第二次PCR鉴定上游引物为SEQ ID NO:7，下游引物为SEQ ID NO:8。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤C）副猪嗜血杆菌双基因缺失株的构建中，第一次PCR鉴定时，上游引物为SEQ ID NO:9，下游引物为SEQ ID NO:10，第二次PCR鉴定上游引物为SEQ ID NO:7，下游引物为SEQ ID NO:8。
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