[发明专利]兔出血症病毒样颗粒、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域、基因工程领域及兽医生物制药领域，具体地说，涉及一种兔出血症病毒样颗粒、其制备方法及应用。 

背景技术

兔病毒性出血症俗称兔瘟，是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种急性、烈性、高度接触性和致死性传染病。因曾是兔的一种毁灭性传染病，给养兔业带来巨大的经济损失而备受养兔业的关注。l984年中国首次报道了该病。1989年，世界动物卫生组织(OIE)将该病正式列为B类传染病，我国将其列为二类传染病（王永坤等,兔瘟的诊断与防治,1992）。 

在2000年国际病毒分类委员会(ICTV)的第七次报告中，将兔出血症病毒列入了杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。RHDV病毒粒子呈球形，无囊膜，直径32-36nm，20面体对称(张丽红等,广东畜牧兽医科技,31:9-11,2006)。其衣壳由32个高4-6nm的圆柱状壳粒构成，由主要结构蛋白VP60多重拷贝所组成，核心直径为17-23nm。负染电镜表面具有嵌杯样病毒典型的杯状形态结构，电镜下还可见少数没有核心的病毒空衣壳。病毒在氯化铯中的浮密度为1.29-1.34g/cm³，沉降系数为85-162S(李海等,贵州畜牧兽医,28:10-11,2004)。 

RHDV基因组为单股正链RNA，全长7437bp，分子量为(2.4x10⁶-2.6x10⁶)KD，5’末端无帽状结构，3’末端有一个短的polyA尾。RHDV基因组含2个开放阅读框。5’末端的长开放阅读框架（ORF1）编码一个2344氨基酸的多聚蛋白前体，它被病毒蛋白酶进一步分解为衣壳蛋白和多个非结构蛋白，其中衣壳蛋白为病毒的主要结构蛋白，称为VP60，与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关。3’末端的短开放阅读框架（ORF2），位于7025-7378bp之间，编码病毒另一个小的结构成分，称为VP10，碱性蛋白且含量较低，可能在病毒粒子中与病毒RNA结合。除基因组RNA外，在感染的组织和病毒颗粒中还含有2.4kb的亚基因组RNA，也编码衣壳蛋白，并且该片段在5’端也与VPg蛋白共价结合（严维巍等,中国养兔杂志,1:26-29,2001）。 

VP60的N-端组成衣壳蛋白的内部区，C-端组成衣壳蛋白的外部。N-端的第 31-250之间的氨基酸是主要的抗感染免疫决定区。对VP60蛋白的研究发现，体外表达该衣壳蛋白时，在没有其他任何成分存在的条件下，可自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(Rob N,Virus-like particle as immunogens,Trends in Microbiology,11:438–444,2003)。近年来，应用病毒样颗粒作为疫苗的抗原载体逐渐受到科学家们的重视。病毒样颗粒是模拟病毒的颗粒形态特点，将外源基因片段产物呈递到病毒颗粒表面而形成的嵌合颗粒，它的外部形态与病毒颗粒相同，甚至还有某些病毒受体的天然配体；同时，还可将其他病原的特异性抗原等呈递在颗粒表面，因而在病原体的疫苗研究中发挥着重要的作用。VLPs常可以诱导产生较灭活疫苗和可溶性多肽更为强烈的体液免疫应答，因为其表面是以非感染性的颗粒状态模拟天然抗原呈递过程来呈递糖蛋白抗原的，而该方法提呈引起的免疫应答优于溶解状态，故在保护作用中起重要作用的糖蛋白抗原引起的免疫应答可望更接近自然感染，这样，病毒样颗粒更有可能广泛用于疫苗的研制。并且，由于VLPs不包裹核酸，不能复制，因此也没有感染性，是一种安全的抗原载体(Nagesha H S,Virus-like particles of calicivirus as epitope carriers,Arch Virol,144:2429-2439,1999)。