[发明专利]兔出血症病毒样颗粒、其制备方法及应用

权利要求书

1.兔出血症病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据昆虫细胞偏爱密码子对兔出血症病毒VP60基因进行优化，得到优化的兔出血症病毒VP60基因；

（2）重组杆状病毒Bacmid质粒的构建：将优化的VP60基因插入到昆虫细胞高效表达载体中，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒；

（3）重组杆状病毒的拯救：用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒；

（4）兔出血症病毒样颗粒的制备：将获得的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养后收获上清，即得到兔出血症病毒样颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中优化的兔出血症病毒VP60基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述昆虫细胞高效表达载体选自AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII(pETL)、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX1.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBacDual、pFastBac1、pFastBacHT A、pFastBacHT B、pFastBacHT C、pFastBacDual中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的昆虫细胞高效表达载体为pFastBacDual。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将优化的VP60基因分别构建到pFastBacDual中P_H和P₁₀两个启动子的下游，形成两个高效表达盒。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）和（4）中使用的昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Sf21、Sf9、Mimic Sf9细胞系、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）Se301细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG1细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4细胞系、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）BTI-Tn-5B1-4细胞系、BTI-Tn-5C1细胞系、BTI-Tn-5F2细胞系，斜纹贪夜蛾（Spodoptera litura）ZSU-S1-1细胞系、IBL-SL1A细胞系和家蚕卵巢细胞系BmN中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）和（4）中使用的昆虫细胞分别为Sf9细胞、BTI-Tn-5B1-4细胞。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法制备的兔出血症病毒样颗粒。

9.权利要求8所述的兔出血症病毒样颗粒在制备兔出血症疫苗中的应用。

10.一种兔出血症疫苗，其特征在于，将权利要求8所述的兔出血症病毒样颗粒辅以防腐剂和佐剂制备而成。