[发明专利]一种致敏鸡红细胞的制备方法及IBV检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测用材料的制备方法及其检测试剂盒，特别涉及一种用于间接血凝检测IBV抗体的致敏鸡红细胞的制备方法及IBV检测试剂盒。

背景技术

传染性支气管炎（IB）是鸡的一种急性、高度接触性传染的病毒性呼吸道和泌尿生殖道疾病。其特征是咳嗽、喷嚏、气管啰音和呼吸道粘膜呈浆液性卡他性炎症。本病流行呈世界性分布，可感染所有品种和日龄的鸡，导致病鸡生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低，成年鸡感染后主要表现为开产期推迟，产蛋量、蛋品质明显下降，康复后的蛋鸡产蛋量很难恢复到患病前的水平，本病常常引起霉形体、大肠杆菌等的继发感染而提高鸡群的死亡率，给养鸡业带来巨大的经济损失。

IBV的血清型众多，据不完全统计，迄今已至少发现27个血清型，而且新的血清型和变异株还在不断出现，这就给IB的预防带来很大困难。据调查，我国目前大部分地区的IBV毒株属于Massachusetts血清型和基因型（其代表株为M41株）。主要引起呼吸道症状。但有些地区也存在类似美国Gray株和Holte株的野毒的局部流行，其共同特点是引起典型肾脏损伤。

国内外普遍采用Massachusetts血清型的H120和H52弱毒疫苗来控制IB，对于饲养周期长的蛋鸡和种鸡于开产前接种一次IB油乳剂灭活疫苗，代表株为M41株，这与该毒株的流行最广泛有关。因IBV变异很快，所以用疫苗前必须掌握当地流行的病毒血清型，并使用与当地流行毒株抗原性一致的疫苗品系 ，这样才能达到有效的免疫预防目的。

目前国内外IBV抗体的血清学检测方法主要包括病毒中和试验、琼脂扩散试验、血凝抑制试验、ELISA等。以上血清学检测方法可能由于试验对象的个体差异会导致试验结果的不准确，琼脂扩散试验相对于IB灵敏度较差，有些血清型很难出现沉淀线，临床上很少用该方法进行IB抗体的检测，HI和ELISA灵敏度高，生产成本也随之提高，临床上抗体检测较常用的为HI，目前国内尚未有提供较好的IB凝集抗原的厂家，需从荷兰Gezonheidsdienst Voor Dieren B.V.公司购买，这就大大提高了检测成本。

在病原抗体检测领域，IHA(间接血凝试验)经过大量试验验证，是一项简便、快速、结果准确、可重复性强、经济实用的检测技术，可应用于临床抗体的大量、快速检测，值得推广应用。在IHA实验中，红细胞的处理至关重要，直接影响检测速度和检测结果的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于间接血凝检测IBV抗体的鞣化鸡红细胞的制备方法。

本发明的另一个目的在于提供一种IBV检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种致敏鸡红细胞的制备方法，包括如下步骤：

1)      细胞固化：将新鲜鸡红细胞用缓冲液洗涤干净，加入醛溶液稀释，振荡反应，洗涤得到固化鸡红细胞；

2)      细胞鞣化：将固化鸡红细胞稀释，加入鞣酸，得到鞣化鸡红细胞；

3)      细胞致敏：将鞣化鸡红细胞稀释，加入IBV液混合作用，得到致敏鸡红细胞。

作为本发明的进一步改进，细胞固化的操作为：

1)      将新鸡红细胞用pH7.0 PBS液洗涤干净，通过离心沉淀将红细胞分离；

2)      将红细胞用PBS液悬浮，加入戊二醛进行固化处理，振荡处理10 min以上至固化完全且红细胞未发生自凝；

3)      用pH7.0 PBS液将戊二醛固化处理后的红细胞洗涤干净，得到固化鸡红细胞。

优选的，在进行细胞固化时，红细胞悬液中，红细胞的浓度为8.48×10⁸～8.72×10⁸个/ml，戊二醛的质量浓度为0.3～1.25‰。

作为本发明的进一步改进，细胞鞣化的操作为：将固化鸡红细胞用稀释液稀释制成悬液，在悬液中加入鞣酸，鞣化处理20～90 min，之后用PBS液洗净。

优选的，稀释后的固化鸡红细胞悬液中，红细胞的浓度为8.52×10⁸～8.68×10⁸个/ml，鞣酸的质量浓度为0.125～0.5%。稀释液为蒸馏水。

作为本发明的进一步改进，细胞致敏的操作为：将鞣化鸡红细胞稀释至4.26×10⁸～4.34×10⁸个/ml，与IBV病毒混合，35～40℃作用15～45 min，之后洗涤干净，得到致敏鸡红细胞。