[发明专利]猪传染性胃肠炎核酸疫苗及其免疫增强剂和制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种猪传染性胃肠炎核酸疫苗及其免疫增强剂和制备方法。

背景技术

核酸疫苗(nucleic acid vaccine)，也称基因疫苗(genetic vaccine)，是指将含有编码的蛋白基因序列的质粒载体，经肌肉注射等方法导入宿主体内，通过宿主细胞表达抗源蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗源蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。

核酸疫苗是利用现代生物技术免疫学、生物化学、分子生物学等研制成的，分为DNA疫苗和RNA疫苗两种。但目前对核酸苗的研究以DNA疫苗为主。DNA疫苗导入宿主体内后，被细胞(组织细胞、抗原递呈细胞或其它炎性细胞)摄取，并在细胞内表达病原体的蛋白质抗原，通过一系列的反应刺激机体产生细胞免疫和体液免疫。

近年来由于生物分子学的发展，使得免疫学进入了分子免疫的时代，其标志着各种免疫增强剂的研究和发展。如何进一步提高传统疫苗的免疫效果是今后努力的方向。免疫佐剂指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫应答类型的物质，包括无机佐剂(如氢氧化铝)、有机佐剂(如脂多糖、分支杆菌)及合成佐剂穴如双链多聚肌苷酸，胞苷酸眼。近年来随着细胞因子研究的进展，发现许多细胞因子也具有明显的免疫佐剂效应，能增强特异抗原的免疫原性或增强机体对抗原的反应性，这些细胞因子包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12等。

目前，市面上的猪传染性胃肠炎疫苗多为灭活苗或活疫苗，其都有各自的缺陷。核酸疫苗还处于研究阶段，已报道，猪传染性胃肠炎病毒的纤突蛋白(TGEV S基因)有主要的抗原性。其中，S基因有A,B,C，D四个主要的抗原位点。有报道，S基因的前半段包含主要的抗原位点，并且免疫效果优于全长S基因，但是，免疫效果一般所以有必要针对提高其免疫效果来进行研究。

发明内容

基于以上不知之处，本发明的目的在于通过免疫佐剂作用与猪传染性胃肠炎病毒核酸疫苗，来提高猪传染性胃肠炎核酸疫苗的免疫效果，延长免疫应答的持续时间。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

1、一种猪传染性胃肠炎核酸疫苗pVAX-TGEV S1，序列如序列表Seq No.1所示。

2、一种对猪传染性胃肠炎核酸疫苗的免疫增强剂pVAX-pIL12p(40)-linker-pIL12p(35)，序列如序列表Seq No.2所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、如上所述一种猪传染性胃肠炎核酸疫苗，用于扩增猪传染性胃肠炎病毒TGEV S1的引物对，上引物P1：如序列表Seq No.3所示，下引物P2：如序列表SeqNo.4所示。

2、如上所述一种对猪传染性胃肠炎核酸疫苗的免疫增强剂pVAX-pIL12p(40)-linker-pIL12p(35)，用于扩增pIL12p(40)的引物对，上引物P3：如序列表Seq No.5所示，下引物P4：如序列表Seq No.6所示；用于扩增pIL12p(35)的引物对，其特征在于，上引物P5：如序列表Seq No.7所示，下引物P6：如序列表SeqNo.8所示。

3、一种猪传染性胃肠炎核酸疫苗pVAX-TGEV S1的构建方法，包括如下步骤：

(1)根据质粒PMD-18-T-TGEV-S基因的核苷酸序列设计引物对，上引物P1，序列如序列表Seq No.3所示，下引物P2，如序列表Seq No.4所示；

(2)进行常规链式聚合酶反应扩增TGEV S1基因；

(3)构建重组质粒pVAX-TGEV S1。

4、如3所述的一种猪传染性胃肠炎核酸疫苗pVAX-TGEV S1的构建方法，所述步骤(2)采用常规链式聚合酶反应扩增TGEV S1基因的具体步骤如下：将混合液在95℃5min预变性；然后94℃1min；45.7℃1min；72℃2min；30个循环，最后72℃10min。

所述混合液组成如下：

5、如3所述的一种猪传染性胃肠炎核酸疫苗pVAX-TGEV S1的构建方法，所述的步骤(3)重组质pVAX-TGEV S1的构建方法具体步骤如下：先将PCR产物TGEV S1基因经HindIII和EcoR I酶切，利用胶回收试剂盒回收纯化目的基因片段，将纯化后的目的基因克隆入表达载体pVAX1的HindIII和EcoR I位点，将鉴定正确的重组质粒命名为pVAX-TGEV S1。