[发明专利]一种破骨细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养方法，具体涉及骨髓细胞诱导的破骨细胞的培养方法。

背景技术

破骨细胞来源于骨髓造血干细胞,由单个核前体细胞融合而成，是在人体里唯一具有骨吸收机能的细胞，主要分布在主要分布在骨质表面、骨内血管通道周围。

成熟破骨细胞是含有2-50个紧密堆积的核的巨大细胞，具有较强的骨吸收能力，在体外培养的破骨细胞可以在骨片或象牙表面上形成骨吸收陷窝。电镜观察结果表明，在陷窝内对着骨质的一面，细胞伸出许多细胞突起，称为皱褶缘(ruffled border)。在皱褶缘区的周缘有一环形的胞质区，含多量微丝，但缺乏其它细胞器，称为亮区(clear zone)，此处的细胞膜平整并紧贴在骨质的表面。在骨吸收时，破骨细胞不断向局部（陷窝）释放乳酸及柠檬酸等，形成强酸性（pH值达到2-3），溶解骨内无机矿物质。

在正常的生理条件下，破骨细胞与与成骨细胞相协助，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用。但今年来的研究发现，在肿瘤、骨质疏松症和炎症等病理条件下，破骨细胞也起到很重要的作用，在体外培养破骨细胞是研究破骨细胞与这些疾病的发病机制以及治疗药物开发的必要途径。

目前为止，破骨细胞的培养方法主要有原代培养方法和骨髓诱导培养方法。其中原代培养方法得到的破骨细胞数量少，且得到的细胞大多为成熟破骨细胞，不适合用于破骨细胞增殖、分化方面的研究。骨髓诱导培养方法，虽然得到充足的破骨细胞来源，但目前的培养方法得到的破骨细胞具有其性质与体内原有破骨细胞有差异，具有噬骨能力差等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种其性质更接近于原代破骨细胞、且噬骨能力强的骨髓细胞来源的破骨细胞的培养方法。

本发明的技术方案为如下：

一种破骨细胞的培养方法，包括如下步骤：

（1）收集大鼠大腿骨和胫骨中的骨髓细胞，悬浮于细胞培养液中；

（2）细胞悬浮液通过葡聚糖凝胶Sephadex G10色谱柱，用细胞培养液洗涤，收集细胞；

（3）收集得到的细胞种于培养板内，培养板内添加含有细胞因子的培养基共同培养，每隔2天换液，培养4-7天，即可得到破骨细胞；

其中，步骤（3）中所述培养基为含有10^-8M1a,25(OH)₂D₃、20-100ng/ml破骨细胞生成因子、10-50ng/ml巨噬细胞集落刺激因子、15-20%胎牛血清的DMEM。

在优选的技术方案中，步骤（1）或（2）所述的细胞培养液为含有15-20%胎牛血清的DMEM。

在优选的技术方案中，步骤（3）中种于培养板中的细胞数为1×10⁶-4×10⁶个/cm²。

在优选的技术方案中，步骤（1）所述大鼠为4-6周龄。

本发明的方法得到的破骨细胞，显示很强的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP+)染色活性，在象牙片的骨吸收实验中也显示强的骨吸收能力。

传统的骨髓细胞诱导的破骨细胞的额培养周期比较长，有的甚至长达3周，但本发明最短4天内就能得到骨吸收能力好，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP+)染色活性强的破骨细胞。本发明的破骨细胞培养方法简单，使用的相关细胞因子价格低，使用量少，培养成分低。另一方面，本发明的方法得到的破骨细胞数量多，可以满足破骨细胞相关细胞分子生物学实验和研究。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或可以常规方法制备。

实施例1破骨细胞的培养