[发明专利]驴的细管冷冻精液制作方法及应用

说明书

技术领域：

    本发明涉及驴的驴的细管冷冻精液制作。

技术背景:

采用假阴道法采集成年种公驴精液，经品质评定后，用5种不同冷冻保存液稀释、平衡，冷冻保存制作细管冷冻精液，以筛选适宜的驴精液冷冻保存液和冷冻保护剂。结果表明：乳糖-葡糖-甘油-卵黄液为最佳种冷冻保存液（P〈0.05）；甘油为最佳冷冻保护剂，其适宜浓度为5％，精子冻后活率平均为0.36，畸形率≤27．4％，顶体完整率82．2％，解冻后常温下精子存活时间为8．2h。

发明内容：

    驴在马匹改良中具有重要作用，驴细管冷冻精液（以下简称冻精）是指将采集到的驴的新鲜精液，经过精液品质检测、原精液离心浓缩和添加特制冷冻稀释保护液等特殊处理后，把精液封装在微型（0.25ml)塑料细管内，利用液氮为冷源，按特定的程序和冷冻速度进行冷冻，使精液以冻结的形式保存于超低温环境下，达到长期保存驴精液的目的。驴细管冻精的制作和使用，有利于扩大优良种公驴的改良覆盖面和提高其利用率，驴细管冻精冷冻保存不受驴活体有限生命的限制，可最大限度的延长使用期限。

具体实施方式：

1.驴精液的采集:驴用假阴道法采精，采精前选择发情明显，性情温顺的母驴或母马作为台马并保定在保定架内，确保人畜安全，再把公驴牵到采精架，让公驴爬跨发情台畜数次，爬跨时采精员控制保护公驴阴，茎防止公驴与台畜发生本交，当公驴性兴奋充分，阴茎充分勃起将阴茎导入准备好的假阴道采精，当公驴阴茎插入假阴道并抽动数次后即可射精。

2.细管冻精制作设备：相差显微镜，分光光度计，普通离心机，MRS-3自动分装机，程控冷冻仪，广口液氮生物容器，液氮，微型塑料细管，拇指管，电冰箱，低温操作柜，细管冷冻架，玻片，量筒，量杯，离心试管，恒温水浴锅，移液器和稀释液等。

3.驴冷冻稀释液的配制:用正交法筛选适合驴细管冻精使用的冷冻稀释液，稀释液的主要成分为：葡萄糖，甘氨酸，蔗糖，甘油，卵黄和蒸馏水，配制时称量试剂必须准确，试剂称量后混合、完全溶解、滤纸过滤和消毒待用。

4.驴精液的处理：a.过滤:采集到的驴精液用经消毒的脱脂纱布过滤，滤除杂质和部分副性物。b.测量采精量:过滤后的驴精液用量筒测量采精量，记录采精量。c.驴精子密度的测定:取驴精液样品100微升，加入0.7%的氯化钠溶液1900微升，充分混匀，放入分光光度计比色槽测定精子密度，记录精子密度。d.检查原精活力:取驴原精样品5-10微升滴在载玻片上，用盖玻片压片在显微镜下观察精子活力，精子活力60%以上的驴精液可用于制作细管冻精。e.驴精液稀释后总量的确定，根据驴原精液活力、采精量、细管容积、精子密度和每剂量有效精子数（每剂量有效精子数1500-2000万个）确定稀释后精液的总量,计算公式为：稀释液后精液总量=0.25*0.35*精子密度*采精量/0.15。

5.驴精液的离心浓缩：驴精液稀释后精液总量的确定后，把驴精液分装于刻度离心试管，放入离心机中，以2000转/分的速度离心10～15分钟，尽量吸出上清液，计量所吸出的上清液。

6.驴精液的稀释：在吸去上清液的精液中加入冷冻稀释液至稀释后精液的总量并混匀，稀释液的添加量等于稀释液后精液总量减去离心去除上清液的数量。

7.精液的分装，稀释后的驴精液用MRS-3自动分装机在实验室室温下分装在微型塑料细管内，封口和印字。

8.驴细管精液的平衡，分装后的细管精液放置于+4℃的温度下保存4～12小时。

9.驴细管精液的冷冻，平衡后的驴精液在+4℃左右温度下整齐放在细管冷冻架上，然后把细管冷冻架和精液放入程控冷冻仪冷冻,冷冻曲线为：+4℃至 -100℃，冷冻速度为60℃/mn.-100℃至 -140℃， 冷冻速度为20℃/mn，然后把冻结后的细管冻精浸入液氮中进行超低温冻结；广口液氮生物容器冷冻：平衡后的驴精液在+4℃左右温度下整齐放在细管冷冻架上，然后把细管冷冻架和精液放入-120～-140℃的液氮蒸汽中冷冻15-20分钟，然后把冻结后的细管冻精浸入液氮中进行超低温冻结。

10.驴细管冻精的解冻检查和保存：冷冻后的驴细管冻精随机抽取1-2支，立即放入40±2℃的水浴中解冻，检查解冻活力，解冻活力可达35～40%，解冻活力35%以上的驴细管冻精包装放于液氮中长期保存。

11.驴细管冻精的使用，冷冻解冻后活力达35%以上的驴细管冻精即可用于人工授精，一个情期输精两次，每次使用细管冻精2～3支，总受胎率可达60～70%。