[发明专利]驴的细管冷冻精液制作方法及应用

权利要求书

1.驴精液的采集，其特征是驴用假阴道法采精，采精前选择发情明显，性情温顺的母驴或母马作为台马并保定在保定架内，确保人畜安全，再把公驴牵到采精架，让公驴爬跨发情台畜数次，爬跨时采精员控制保护公驴阴，茎防止公驴与台畜发生本交，当公驴性兴奋充分，阴茎充分勃起将阴茎导入准备好的假阴道采精，当公驴阴茎插入假阴道并抽动数次后即可射精。

2.细管冻精制作设备，其特征是相差显微镜，分光光度计，普通离心机，MRS-3自动分装机，程控冷冻仪，广口液氮生物容器，液氮，微型塑料细管，拇指管，电冰箱，低温操作柜，细管冷冻架，玻片，量筒，量杯，离心试管，恒温水浴锅，移液器和稀释液等。

3.驴冷冻稀释液的配制，其特征是用正交法筛选适合驴细管冻精使用的冷冻稀释液，稀释液的主要成分为：葡萄糖，甘氨酸，蔗糖，甘油，卵黄和蒸馏水，配制时称量试剂必须准确，试剂称量后混合、完全溶解、滤纸过滤和消毒待用。

4.驴精液的处理，其特征是a过滤:采集到的驴精液用经消毒的脱脂纱布过滤，滤除杂质和部分副性物,b测量采精量:过滤后的驴精液用量筒测量采精量，记录采精量,c驴精子密度的测定:取驴精液样品100微升，加入0.7%的氯化钠溶液1900微升，充分混匀，放入分光光度计比色槽测定精子密度，记录精子密度,d检查原精活力:取驴原精样品5-10微升滴在载玻片上，用盖玻片压片在显微镜下观察精子活力，精子活力60%以上的驴精液可用于制作细管冻精,e驴精液稀释后总量的确定，根据驴原精液活力、采精量、细管容积、精子密度和每剂量有效精子数（每剂量有效精子数1500-2000万个）确定稀释后精液的总量,计算公式为：稀释液后精液总量=0.25*0.35*精子密度*采精量/0.15。

5.驴精液的离心浓缩，其特征是驴精液稀释后精液总量的确定后，把驴精液分装于刻度离心试管，放入离心机中，以2000转/分的速度离心10～15分钟，尽量吸出上清液，计量所吸出的上清液。

6.驴精液的稀释，其特征是在吸去上清液的精液中加入冷冻稀释液至稀释后精液的总量并混匀，稀释液的添加量等于稀释液后精液总量减去离心去除上清液的数量。

7.精液的分装，其特征是稀释后的驴精液用MRS-3自动分装机在实验室室温下分装在微型塑料细管内，封口和印字。

8.驴细管精液的平衡，其特征是分装后的细管精液放置于+4℃的温度下保存4～12小时。

9.驴细管精液的冷冻，其特征是平衡后的驴精液在+4℃左右温度下整齐放在细管冷冻架上，然后把细管冷冻架和精液放入程控冷冻仪冷冻,冷冻曲线为：+4℃至 -100℃，冷冻速度为60℃/mn.-100℃至 -140℃， 冷冻速度为20℃/mn，然后把冻结后的细管冻精浸入液氮中进行超低温冻结；广口液氮生物容器冷冻：平衡后的驴精液在+4℃左右温度下整齐放在细管冷冻架上，然后把细管冷冻架和精液放入-120～-140℃的液氮蒸汽中冷冻15-20分钟，然后把冻结后的细管冻精浸入液氮中进行超低温冻结。

10.驴细管冻精的解冻检查和保存，其特征是冷冻后的驴细管冻精随机抽取1-2支，立即放入40±2℃的水浴中解冻，检查解冻活力，解冻活力可达35～40%，解冻活力35%以上的驴细管冻精包装放于液氮中长期保存。

11.驴细管冻精的使用，其特征是冷冻解冻后活力达35%以上的驴细管冻精即可用于人工授精，一个情期输精两次，每次使用细管冻精2～3支，总受胎率可达60～70%左右。