[发明专利]利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法。

背景技术

辅助性T细胞17（Th17）是CD4+的免疫细胞亚群，它与多种免疫性疾病和炎症性疾病有密切关系，Th17细胞主要通过分泌人白介素17A（IL-17A）、人白介素17F（IL-17F）等细胞因子参与炎症的发生，这些细胞因子主要刺激血管内皮细胞分泌黏附分子，进而介导炎细胞对组织的浸润；Th17细胞也可以分泌人白介素21（IL-21）、人白介素22（IL-22）、人白介素26（IL26）等细胞因子并参与炎症影响炎症的进程。RORγt、CD4+是Th17细胞的重要标志之一。因此，通常利用IL-17+CD4+和RORγt+CD4+作为Th17细胞的标记用于流式检测，但是由于体内Th17细胞的数量有限，现有的分选方法并不能获得数量较多的Th17细胞。并且，由于RORγt、IL-17均为细胞内分泌因子，因此分选前需要先对细胞打孔然后染色，这使得细胞的活性无法保障，严重影响后续体外实验。

因此，急需一种分选Th17细胞的方法，其获得量多，并分选的细胞活力，为进一步研究Th17细胞奠定了基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法，能够在短时间内获得大量功能性的Th17细胞，方法简单，易于操作，节省时间。

为实现上述发明目的，技术方案为：

利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法，包括如下步骤：

B.收集小鼠外周血，加入PBS稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/4-2倍，然后在转速为2000-2500rpm条件下离心20-30分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层体积1-20倍的PBS洗涤，离心收集细胞，用PBS液重悬细胞后分离CD4⁺CD45RO⁺T细胞；

B.将步骤A分离的CD4⁺CD45RO⁺T细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161和CCR6三种抗体染色，用PBS洗涤细胞后在800-1600rpm条件下离心8-15分钟，然后用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23R^-CD161^-CCR6^-细胞；

C.将步骤B所得IL23R^-CD161^-CCR6^-细胞加入含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清体积分数为10%，然后置于37℃、体积分数为5%的CO₂培养箱内培养5-8小时，再加入100-2000ng/mL的小鼠CD3抗体和30-400ng/mL的重组人IL-26刺激细胞2-24小时，收集细胞，得为小鼠Th17细胞。

优选的，所述步骤A为收集小鼠外周血，加入等体积的0.01mol/L、pH7.2的PBS稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/3，然后在转速为2000rpm条件下离心20分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层10倍体积的PBS洗涤，离心收集细胞，用PBS液重悬细胞后分离CD4⁺CD45RO⁺T细胞。

优选的，所述步骤B为将步骤A所得CD4⁺CD45RO⁺T细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161和CCR6三种抗体在10℃下染色30分钟，用PBS洗涤细胞三次后在800rpm条件下离心10分钟，然后用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23R^-CD161^-CCR6^-细胞。

优选的，所述步骤C是将步骤B所得IL23R^-CD161^-CCR6^-细胞收集于96孔板中，每孔加入200μL含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清的体积百分比为10%，然后置于37℃、体积分数为5%的CO₂培养箱内培养5小时，再加入500ng/mL的小鼠CD3抗体和100ng/mL的重组人IL-26刺激细胞10小时。