[发明专利]利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法

权利要求书

1.利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A.收集小鼠外周血，加入PBS稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/4-2倍，然后在转速为2000-2500rpm条件下离心20-30分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层体积1-20倍的PBS洗涤，离心收集细胞，用PBS液重悬细胞后分离CD4⁺CD45RO⁺T细胞；

B.将步骤A分离的CD4⁺CD45RO⁺T细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161和CCR6三种抗体染色，用PBS洗涤细胞后在800-1600rpm条件下离心8-15分钟，然后用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23R^-CD161^-CCR6^-细胞；

C.将步骤B所得IL23R^-CD161^-CCR6^-细胞加入含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清体积分数为10%，然后置于37℃、体积分数为5%的CO₂培养箱内培养5-8小时，再加入100-2000ng/mL的小鼠CD3抗体和30-400ng/mL的重组人IL-26刺激细胞2-24小时，收集细胞，得为小鼠Th17细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤A为收集小鼠外周血，加入等体积的0.01mol/L、pH7.2的PBS稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/3，然后在转速为2000rpm条件下离心20分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层10倍体积的PBS洗涤，离心收集细胞，用PBS液重悬细胞后分离CD4⁺CD45RO⁺T细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤B为将步骤A所得CD4⁺CD45RO⁺T细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161和CCR6三种抗体在10℃下染色30分钟，用PBS洗涤细胞三次后在800rpm条件下离心10分钟，然后用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23R^-CD161^-CCR6^-细胞。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤C是将步骤B所得IL23R^-CD161^-CCR6^-细胞收集于96孔板中，每孔加入200μL含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清的体积百分比为10%，然后置于37℃、体积分数为5%的CO₂培养箱内培养5小时，再加入500ng/mL的小鼠CD3抗体和100ng/mL的重组人IL-26刺激细胞10小时。