[发明专利]一种胞外α-酮戊二酸产量提高的解脂亚洛酵母基因工程菌

权利要求书

1.一种胞外α-酮戊二酸产量提高的基因工程菌，其特征在于，是在解脂亚洛酵母（Yarrowia lipolytica）WSH-Z06中过量表达编码酮酸转运蛋白的基因。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码酮酸转运蛋白的基因的核苷酸序列如以下（1）或（2）或（3）或（4）所示：

（1）NCBI登录号为YALI0B19470g的核苷酸序列，

（2）NCBI登录号为YALI0C21406g的核苷酸序列，

（3）NCBI登录号为YALI0D20108g的核苷酸序列，

（4）NCBI登录号为YALI0E32901g的核苷酸序列。

3.构建权利要求2所述基因工程菌的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）构建表达目的基因所用的含有潮霉素磷酸转移酶为筛选标记的整合型表达载体p0(hph)；

（2）构建重组表达质粒：根据NCBI公开的序列，全化学合成目的酮酸转运蛋白基因的开放阅读框部分，并通过限制内切酶同时切割获得的基因和整合型表达载体p0(hph)，连接酶切产物获得重组表达质粒；

（3）将所得重组质粒转化Y.lipolytica WSH-Z06：利用电穿孔转化方法将被线性化的重组质粒转化野生型Y.lipolyticaWSH-Z06，进行验证筛选阳性转化子。

4.利用权利要求2所述基因工程菌发酵生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于，将所得重组基因工程菌接种至种子培养基中，28℃、200rpmin，培养16-18小时；按10%的接种量从种子培养基中接种到3L发酵罐中，温度为28℃、通气量为1.5vvm，搅拌转数为400rpm，培养144-168小时。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子培养基成分为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，KH₂PO₄1g/L，调pH为5.5。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为：甘油100g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O1.2g/L，NaCl0.5g/L，K₂HPO₄0.1g/L，盐酸硫胺素2×10^-7g/L，调pH为5.0后再加入20g/L CaCO₃。